食源性疾病是全球最重要的公共衛(wèi)生問題之一,導致食源性疾病的有病原微生物、寄生蟲及其代謝產(chǎn)物、天然毒素以及化學性有毒有害物質(zhì)等等。微生物引起的食源性疾病是全球食品安全面臨的最重要挑戰(zhàn)之一。在發(fā)達國家70%～80%的細菌性食物中毒是由沙門氏菌引起的,在我國甚至達到90%;引起沙門氏菌中毒的食品中,蛋類、奶類等動物性產(chǎn)品約占90%,沙門氏菌生存能力較強,可在乳制品中生存幾個月。單增李斯特菌廣泛存在于自然界中,且在冷藏溫度4℃下依然能夠生長,引起單增李斯特菌食物中毒的食品主要有:奶及奶制品、肉制品、水產(chǎn)品、蔬菜及水果,其中以乳制品最為常見,單增李斯特菌能夠給高風險人群帶來嚴重的感染性疾病。志賀氏菌又稱痢疾桿菌,是引起人類細菌性痢疾中最為常見的食源性致病菌,該菌也是食品衛(wèi)生相關法規(guī)及標準中要求必須檢測的項目之一。本文以牛奶中常見的食源性致病菌單增李斯特菌、沙門氏菌和志賀氏菌為目標菌種,利用環(huán)介導等溫擴增技術和高分辨率熔解曲線技術建立了多重LAMP檢測體系和多重HAND-HRM檢測體系,結(jié)果如下:1.針對單增李斯特菌溶血素蛋白（hly）基因、沙門氏菌侵襲蛋白A（invA）基因和志賀氏菌侵襲性質(zhì)�？�... 

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 緒論
    第一節(jié) 食源性疾病
    第二節(jié) 三種食源性致病菌
        一、單增李斯特菌
            1. 單增李斯特菌概述
            2. 單增李斯特菌的危害
        二、沙門氏菌
            1. 沙門氏菌概述
            2. 沙門氏菌的危害
        三、志賀氏菌
            1. 志賀氏菌的分類
            2. 志賀氏菌的危害
    第三節(jié) 環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術
    第四節(jié) 高分辨率熔解曲線(HRM)技術
        一、HRM技術的原理
        二、飽和熒光染料
        三、HRM技術的特點
    第五節(jié) 同源加尾系統(tǒng)
    第六節(jié) 研究內(nèi)容與意義
        一、研究內(nèi)容
            1. 多重環(huán)介導等溫擴增反應體系的建立
            2. 基于HAND系統(tǒng)的高分辨率熔解曲線檢測方法的建立
        二、研究意義
第二章 多重LAMP檢測體系的建立
    第一節(jié) 實驗材料與設備
        一、材料
        二、試劑與儀器
        三、培養(yǎng)基
            1. 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基
            2. 3%NaCl營養(yǎng)瓊脂
            3. 胰蛋白胨大豆酵母浸膏(TSA-YE)培養(yǎng)基
    第二節(jié) 方法
        一、細菌基因組DNA的提取
        二、引物設計與合成
        三、LAMP反應體系及優(yōu)化
        四、多重LAMP反應體系的優(yōu)化
        五、多重LAMP反應的特異性及靈敏度檢測
        六、LAMP擴增產(chǎn)物測序
        七、多重LAMP體系對模擬污染牛奶的檢測
        八、多重LAMP體系對實際牛奶樣品的檢測
    第三節(jié) 結(jié)果
        一、引物設計
            1. 單增李斯特菌引物設計
            2. 沙門氏菌引物設計
            3. 志賀氏菌引物設計
        二、最佳引物篩選
        三、單重LAMP反應體系及優(yōu)化
            1. 鎂離子濃度
            2. 甜菜堿濃度
            3. 引物濃度的多重體系優(yōu)化
        四、多重LAMP反應的特異性檢測結(jié)果
        五、多重LAMP反應的靈敏度檢測結(jié)果
        六、LAMP擴增產(chǎn)物測序結(jié)果
        七、模擬污染牛奶模型中多重LAMP靈敏度檢測
        八、實際牛奶樣品的多重LAMP檢測結(jié)果
    第四節(jié) 討論
    第五節(jié) 本章小結(jié)
第三章 基于HAND系統(tǒng)的多重高分辨率熔解曲線檢測系統(tǒng)的建立
    第一節(jié) 實驗材料與設備
        一、材料
        二、試劑與儀器
        三、培養(yǎng)基
    第二節(jié) 方法
        一、細菌基因組DNA的提取
        二、引物設計與合成
        三、基于HAND系統(tǒng)單重反應體系及優(yōu)化
        四、多重HAND-HRM反應體系的優(yōu)化
        五、多重HAND-HRM體系的特異性檢測
        六、多重HAND-HRM體系的靈敏度檢測
        七、評估不同模板濃度對多重HAND-HRM體系檢測的影響
        八、多重HAND-HRM體系穩(wěn)定性檢測
        九、多重HAND-HRM體系擴增產(chǎn)物測序
        十、多重HAND-HRM體系對模擬污染牛奶的檢測
        十一、多重HAND-HRM體系對實際牛奶樣品的檢測
    第三節(jié) 結(jié)果
        一、引物設計結(jié)果
            1. 單增李斯特菌引物
            2. 沙門氏菌引物
            3. 志賀氏菌引物
        二、基于HAND系統(tǒng)單重反應體系及優(yōu)化
            1. 引物篩選
            2. 退火溫度優(yōu)化
        三、多重HAND-HRM反應體系的優(yōu)化
        四、多重HAND-HRM體系的特異性檢測結(jié)果
        五、多重HAND-HRM體系的靈敏度檢測結(jié)果
        六、不同模板濃度對多重HAND-HRM體系檢測影響的評估結(jié)果
        七、多重HAND-HRM體系穩(wěn)定性檢測結(jié)果
        八、多重HAND-HRM體系擴增產(chǎn)物測序
        九、多重HAND-HRM體系對模擬污染牛奶的檢測
        十、實際牛奶樣品的多重HAND-HRM檢測結(jié)果
    第四節(jié) 討論
    第五節(jié) 本章小結(jié)
第四章 結(jié)論與展望
    第一節(jié) 結(jié)論
    第二節(jié) 展望
參考文獻
附錄
致謝
攻讀學位期間發(fā)表的學術論文目錄


【參考文獻】：
期刊論文
[1]2017年晉中市榆次區(qū)食源性疾病主動監(jiān)測實驗室檢測結(jié)果分析[J]. 李麗燕,李靜虹.  臨床檢驗雜志(電子版). 2019(02)
[2]食源性致病菌研究動態(tài)[J]. 黃金林.  食品安全質(zhì)量檢測學報. 2018(07)
[3]環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測肉中單增李斯特菌[J]. 姜霞,滿朝新,趙玥明,周文琦,曲艷艷,龐心怡,姜毓君.  中國食物與營養(yǎng). 2015(11)
[4]環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測志賀氏菌的研究[J]. 馬曉燕,張會彥,宋明明,張先舟,王羽,張偉.  安徽農(nóng)業(yè)科學. 2011(14)
[5]志賀氏菌病發(fā)病機制的研究進展[J]. 康靜靜,楊玉榮,梁宏德.  中國農(nóng)業(yè)科學. 2011(09)
[6]牛奶中布魯氏菌和單增李斯特菌雙重PCR檢測方法的建立[J]. 程媛媛,張彥明,向華,康愷,李艷明,徐磊,董玲娟,張三東.  西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版). 2011(03)
[7]食源性沙門氏菌檢測方法的研究進展[J]. 黃文宇,柳陳堅.  生物技術. 2009(03)
[8]副溶血弧菌LAMP檢測方法的建立[J]. 徐芊,孫曉紅,趙勇,潘迎捷.  中國生物工程雜志. 2007(12)

碩士論文
[1]應用特異性免疫磁珠快速檢測單增李斯特菌[D]. 聞一鳴.暨南大學 2013
[2]可視化LAMP法快速檢測牛乳中單增李斯特菌的研究[D]. 何曉偉.東北農(nóng)業(yè)大學 2013
[3]雞源鮑氏志賀氏菌及其脂多糖對雛雞的致病性研究[D]. 潘國民.河南農(nóng)業(yè)大學 2010



本文編號：3694549