發(fā)布時(shí)間：2022-01-09 13:55

　　噪聲性聽(tīng)力損失（noise-induced hearing loss,NIHL）是由于長(zhǎng)期暴露在噪聲環(huán)境中所引起的感音性耳聾,是最常見(jiàn)的職業(yè)病之一,NIHL目前尚無(wú)有效的治療方法,根本原因在于耳蝸外毛細(xì)胞（Outer hair cells,OHCs）受到噪聲的損害發(fā)生不可逆性死亡,Prestin蛋白是耳蝸OHCs特有的重要感音功能蛋白,是OHCs電運(yùn)動(dòng)以及耳蝸放大效應(yīng)的分子基礎(chǔ),并在OHCs損傷時(shí)呈代償性升高彌補(bǔ)聽(tīng)力損失。目的通過(guò)構(gòu)建耳蝸毛細(xì)胞重組Prestin腺相關(guān)病毒-2（AAV-2）載體,為耳蝸Prestin蛋白調(diào)控研究提供工具,同時(shí)構(gòu)建一種新型無(wú)創(chuàng)的內(nèi)耳基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。方法以豚鼠Prestin基因?yàn)槟０?PCR擴(kuò)增與提取,利用基因工程技術(shù)構(gòu)建AAV-2-Prestin載體,轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的耳蝸毛細(xì)胞（HEI-OC1細(xì)胞株）后1d、3d、5d采用Western blot檢測(cè)Prestin的表達(dá)水平。將構(gòu)建好的重組Prestin腺相關(guān)病毒2型載體,與原位凝膠混合后經(jīng)鼓膜穿刺鼓室給藥的圓窗途徑轉(zhuǎn)染豚鼠內(nèi)耳,免疫熒光法觀察耳蝸組織病毒轉(zhuǎn)染分布,耳蝸基底膜鋪片免疫熒光檢測(cè)綠色熒光蛋白和Prest... 

【文章來(lái)源】：廣東藥科大學(xué)廣東省

【文章頁(yè)數(shù)】：52 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

pAAV-EGFP-Prestin載體圖譜

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文113結(jié)果3.1pAAV-Prestin原病毒質(zhì)粒驗(yàn)證為驗(yàn)證pAAV-Prestin原病毒質(zhì)粒是否構(gòu)建成功，觀察原病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T工具細(xì)胞，在一定的時(shí)間內(nèi)，HEK-293T細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光蛋白表達(dá)說(shuō)明構(gòu)建成功。pAAV-Prestin原病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)，第1d可見(jiàn)微弱熒光表達(dá)，第3d可見(jiàn)熒光表達(dá)達(dá)到高峰，第5d熒光表達(dá)較第3d強(qiáng)度稍有減弱（圖3.1）。圖3.1不同轉(zhuǎn)染時(shí)間綠色熒光蛋白表達(dá)比較3.2AAV-2-Prestin轉(zhuǎn)染HEI-OC1細(xì)胞Prestin表達(dá)結(jié)果熒光顯微鏡下原病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞，出現(xiàn)綠色熒光蛋白表達(dá)，說(shuō)明原病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功，采用AAV-2包裝原病毒質(zhì)粒，為驗(yàn)證包裝后重組病毒載體具有對(duì)體外培養(yǎng)毛細(xì)胞的靶向性，使用AAV-2-Prestin轉(zhuǎn)染HEI-OC1細(xì)胞，WB檢測(cè)轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間內(nèi)Prestin蛋白表達(dá)情況。AAV-2-Prestin轉(zhuǎn)染HEI-OC1細(xì)胞，各組Prestin蛋白表達(dá)水平采用多組均數(shù)比較的方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3.1、圖3.2.1和圖3.2.2，與對(duì)照組相比，不同轉(zhuǎn)染時(shí)間的各組Prestin蛋白表達(dá)水平顯著增高（F=414.755，P＜0.001），3d和5d組

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文12Prestin蛋白表達(dá)水平顯著高于1d（P＜0.001），3d組Prestin蛋白表達(dá)顯著高于5d組（P＜0.001）。表3.1各組Prestin表達(dá)水平比較（±s）組別樣品數(shù)Prestin(相對(duì)灰度值)空白組60.045±0.0021d60.052±0.0013d60.076±0.0025d60.061±0.002F414.755P＜0.001圖3.2.1Western-blot檢測(cè)各組HEI-OC1細(xì)胞中Prestin表達(dá)圖3.2.2各組HEI-OC1細(xì)胞中Prestin蛋白的表達(dá)水平（WB檢測(cè)）注：a表示control組與1d、3d、5d的Prestin蛋白相對(duì)表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P﹤0.05）；b表示1d組與3d、5d的Prestin蛋白相對(duì)表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P﹤0.05）；c表示3d組與5d組的Prestin蛋白相對(duì)表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P﹤0.05）。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]離子敏感型阿奇霉素眼用凝膠的制備及體外釋放研究[D]. 王聰莉.鄭州大學(xué) 2019
[2]IL-10基因重組慢病毒載體不同途徑導(dǎo)入內(nèi)耳局部治療自身免疫性感音神經(jīng)性聾的實(shí)驗(yàn)研究[D]. 陳文博.南京醫(yī)科大學(xué) 2010



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