本文關(guān)鍵詞：全氟烷基化合物與人肝臟脂肪酸結(jié)合蛋白相互作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：全氟烷基化合物(perfluoroalkyl substances, PFAAs)是一類(lèi)結(jié)構(gòu)與脂肪酸類(lèi)似,具有生物富集性和環(huán)境持久性的有機(jī)污染物,被廣泛應(yīng)用于民用和工業(yè)生產(chǎn)中,在環(huán)境樣品、生物樣品及人體內(nèi)廣泛檢出。研究發(fā)現(xiàn),肝臟是PFAAs作用的重要靶器官,一些間接的證據(jù)表明PFAAs可以同血清或肝臟細(xì)胞中的蛋白(如脂肪酸結(jié)合蛋白,FABP等)相互作用,但對(duì)其機(jī)制尚未有深入研究。肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(liver fatty acid binding protein, L-FABP)在肝臟細(xì)胞胞漿中含量豐富,在脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝中起重要作用,其表達(dá)受到過(guò)氧化物酶體增殖受體(peroxisome proliferators-activated receptor, PPARα)等核內(nèi)受體的調(diào)控。本研究克隆表達(dá)了hL-FABP蛋白和4種突變體(S39G、M74G、N111D、R122G),通過(guò)圓二色譜法(CD spectrum)、熒光取代法(fluorescence displacement)、等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry,ITC)、胰酶限制性酶切(trypsin limited digestion)和分子對(duì)接(molecular docking)等技術(shù)和方法,對(duì)PFAAs與hL-FABP的相互作用進(jìn)行研究,以期對(duì)二者的作用模式作出準(zhǔn)確合理的描述。取得的結(jié)果如下：1通過(guò)ITC實(shí)驗(yàn)和熒光取代實(shí)驗(yàn),證實(shí)PFAAs (PFNA、PFOA、PFHxS、PFHxA)可與WT hL-FABP依靠氫鍵和疏水作用非共價(jià)結(jié)合,其親和力隨著碳鏈長(zhǎng)度的增加而增強(qiáng)。PFAAs與hL-FABP的親和力由大到小依次為：PFNAPFOAPFHxSPFHxA。PFOA/PFNA可以以中等強(qiáng)度的親和力與WT hL-FABP的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,其結(jié)合的摩爾比為1：1。2四種突變體中,R122G和N111D分別在結(jié)合摩爾比和親和力上變化明顯：前者結(jié)合摩爾比變?yōu)?.5：1,后者親和力明顯減弱,S39G和M74G與WT hL-FABP沒(méi)有明顯差異。CD實(shí)驗(yàn)、胰酶酶切實(shí)驗(yàn)及分子對(duì)接結(jié)果表明,隨著碳鏈長(zhǎng)度的增加,PFAAs對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)變化的影響也增大,主要表現(xiàn)在α-螺旋含量的增加和β-折疊的減少。R122突變?yōu)镚ly后,蛋白本身在結(jié)構(gòu)上發(fā)生一定改變,即外部結(jié)合位點(diǎn)體積明顯增大。PFAA的結(jié)合對(duì)R122G結(jié)構(gòu)則無(wú)影響,其原因是上述結(jié)構(gòu)上的變化使PFOA無(wú)需"gate keeper"氨基酸轉(zhuǎn)動(dòng)開(kāi)啟內(nèi)部結(jié)合位點(diǎn)即可進(jìn)入。3分子對(duì)接研究表明第一分子PFAA在N111作用下,以"head-in"模式進(jìn)入外部結(jié)合位點(diǎn),之后R122δ CH2發(fā)生旋轉(zhuǎn),將第一分子PFAA拖拽進(jìn)入內(nèi)部位點(diǎn),空出的外部結(jié)合位點(diǎn)即可結(jié)合第二分子的PFAA。因此,PFAAs與hL-FABP的結(jié)合同長(zhǎng)鏈脂肪酸類(lèi)似,與蛋白的內(nèi)外兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)均可以結(jié)合,R122和N111在其結(jié)合過(guò)程中起關(guān)鍵作用。
【關(guān)鍵詞】：全氟烷基化合物 人肝臟脂肪酸結(jié)合蛋白 相互作用 表達(dá)純化 點(diǎn)突變
【學(xué)位授予單位】：廣西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R114
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 第一章 緒論9-21
• 1 全氟烷基化合物(PFAAs)概述9-13
• 1.1 PFAAs的來(lái)源9
• 1.2 PFAAs的分布現(xiàn)狀9-11
• 1.2.1 PFAAs在環(huán)境介質(zhì)中的分布9-11
• 1.2.1.1 水體9-10
• 1.2.1.2 大氣10
• 1.2.1.3 固體介質(zhì)10-11
• 1.2.2 PFAAs在生物介質(zhì)中的分布11
• 1.2.3 PFAAs在人體中的分布11
• 1.3 PFAAs的生物轉(zhuǎn)化與代謝11-13
• 1.3.1 組織分布11-12
• 1.3.2 代謝動(dòng)力學(xué)12
• 1.3.3 PFAAs對(duì)人的毒理學(xué)效應(yīng)12-13
• 2 肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)概述13-16
• 2.1 肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)結(jié)構(gòu)13
• 2.2 L-FABP與脂肪酸及其類(lèi)似物結(jié)合13-15
• 2.3 L-FABP參與脂類(lèi)代謝調(diào)節(jié)及其機(jī)制15-16
• 3 基因體外表達(dá)技術(shù)16-17
• 3.1 表達(dá)系統(tǒng)16
• 3.2 目的蛋白純化16-17
• 4 蛋白與小分子相互作用的研究手段17-20
• 4.1 圓二色譜法(Circular dichroism,CD)17-18
• 4.2 熒光光譜法(fluorescence spectroscopy)18-19
• 4.2.1 熒光猝滅法18-19
• 4.2.2 熒光敏化法19
• 4.3 等溫滴定量熱法(Isothermal Titration Calorimetry,ITC)19
• 4.4 分子對(duì)接(Molecular Docking)19-20
• 5 本研究的目的、意義及研究路線(xiàn)20-21
• 第二章 WT hL-FABP及四種突變體表達(dá)與純化21-30
• 1 主要試劑21
• 2 pET28a-hL-FABP質(zhì)粒及其突變質(zhì)粒的構(gòu)建21-24
• 2.1 培養(yǎng)基配方21-22
• 2.1.1 LB培養(yǎng)基21
• 2.1.2 SOC培養(yǎng)基21-22
• 2.2 目的基因hL-FABP擴(kuò)增22-23
• 2.2.1 人肝細(xì)胞(HL-7702)總RNA提取22
• 2.2.2 cDNA模板的制備(2步法)22
• 2.2.3 hL-FABP的PCR擴(kuò)增22-23
• 2.3 pET28a-hL-FABP質(zhì)粒構(gòu)建23
• 2.4 pET28a-hL-FABP突變質(zhì)粒構(gòu)建23-24
• 2.4.1 突變凝血酶酶切位點(diǎn)24
• 2.4.2 突變關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn)24
• 3 野生型hL-FABP(WT hL-FABP)及其四種突變體的表達(dá)純化24-27
• 3.1 hL-FABP過(guò)表達(dá)24-25
• 3.2 hL-FABP純化25-27
• 4 hL-FABP表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-30
• 4.1 質(zhì)粒構(gòu)建電泳結(jié)果27-28
• 4.2 考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)蛋白過(guò)表達(dá)結(jié)果28
• 4.3. 考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)蛋白純化結(jié)果28-30
• 第三章 hL-FABP與PFAAs相互作用研究30-52
• 1 實(shí)驗(yàn)材料與方法30-35
• 1.1. 主要試劑30
• 1.2 圓二色譜檢測(cè)30-31
• 1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器30
• 1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法30-31
• 1.3 熒光取代實(shí)驗(yàn)31-32
• 1.3.1 實(shí)驗(yàn)儀器31
• 1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法31-32
• 1.4 等溫滴定量熱法(ITC)32-33
• 1.4.1 實(shí)驗(yàn)儀器32
• 1.4.2 實(shí)驗(yàn)方法32-33
• 1.5 限制性酶切實(shí)驗(yàn)33-34
• 1.6 分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)34-35
• 2 hL-FABP與PFAAs相互作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-52
• 2.1 圓二色譜結(jié)果35-40
• 2.2 熒光取代結(jié)果40-43
• 2.3 ITC結(jié)果43-49
• 2.4 胰酶酶切結(jié)果49
• 2.5 分子對(duì)接結(jié)果49-52
• 第四章 討論52-56
• 第五章 總結(jié)56-58
• 1 主要結(jié)論56
• 2 創(chuàng)新點(diǎn)56-57
• 3 不足與展望57-58
• 參考文獻(xiàn)58-64
• 附錄64-66
• 1 pET 28a原核表達(dá)載體圖譜64-65
• 2 主要縮略詞表65-66
• 致謝66-68

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