目的:探討長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA,lnc RNA）H19與S-腺苷高半胱氨酸水解酶（S-adenosylhomocysteine hydrolase,SAHH）相互作用調(diào)控8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶1（8-oxoguanine DNA glycosylase 1,OGG1）甲基化水平在苯并[a]芘（Benzo[a]pyrene,Ba P）致人肺源性細(xì)胞（16HBE、BEAS-2B、VA13）DNA氧化損傷過程中的作用,以期為揭示Ba P暴露致DNA損傷的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制提供相應(yīng)線索。方法:通過si RNA技術(shù)降低人肺源性細(xì)胞中H19及SAHH的表達(dá)水平,構(gòu)建H19低表達(dá)、SAHH低表達(dá)和H19及SAHH雙低表達(dá)細(xì)胞模型,同時設(shè)置轉(zhuǎn)染陰性序列對照組;通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)（載體p CMV-GV141）過表達(dá)人肺源性細(xì)胞中SAHH的表達(dá)水平,構(gòu)建SAHH過表達(dá)細(xì)胞模型（wild type（WT）-SAHH、M1-SAHH,M2-SAHH,M3-SAHH）,同時設(shè)置轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對照組。用不同濃度Ba P（0、1、2、4、8、16、32μmol/L）染毒24h,以16... 

【文章來源】：山西醫(yī)科大學(xué)山西省

【文章頁數(shù)】：90 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖 2 OGG1 甲基化檢測位點及序列將 110mL 70%乙醇、110mL 1×Wash Buffer、90mL Denaturation Buffer、10純水倒入相應(yīng)的 5 個清洗槽；打開并設(shè)置 80℃金屬浴，將 Plate Holder 放；輕柔混勻 Sepharose Beads，配置 Sepharose Beads 和 Binding Buffer 的 M孔反應(yīng)尖底板 80μL 體系（常溫 1400rpm 水平振蕩混勻 20min）：Sephads 3μL，DNA 擴(kuò)增樣品 15μL，Binding Buffer 40μL，Water 20μL。96 孔底板 40μL 體系：annealing Buffer 38.4μL，10μM 測序引物 1.6μL。PyroM6 軟件設(shè)置好運(yùn)行程序，按照程序要求在試劑艙加入相應(yīng)試劑，并把試劑PyroMark Q96 中；打開 vacuum prep workstation 的泵，將 vacuum prep to純水中清洗 3 次（最后一次抽干）；vacuum prep tool 移到 96 孔反應(yīng)尖底Sepharose Beads，然后依次放入 70%乙醇 5s、Denaturation Buffer 5s、1×Wffer 10s（注意需待液體順暢通過后進(jìn)行計時）；取出并豎直 vacuum prep

板中染毒結(jié)束后，D-hanks 平衡鹽溶液清至 1.5mL 離心管中，使用 8-OHdG樣，重復(fù) 3 次。DNA 20min，使用 1M Tris 將 pH 值調(diào)整為磷酸酶，37°C 孵育 30min；沸水煮 10min，按照表 3 配制標(biāo)準(zhǔn)曲線 8 個梯度樣品（倍為標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋標(biāo)品 H 的 OD 值，根據(jù)標(biāo)型標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖 3）。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]DNA修復(fù)基因可變剪接及非編碼RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作為惡性腫瘤發(fā)生及預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志的意義[J]. 逯曉波.  沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報. 2017(04)
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本文編號：3502085