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微囊藻毒素-LR長時(shí)期低劑量暴露對(duì)雌性小鼠生殖功能的影響及其機(jī)制研究

發(fā)布時(shí)間:2017-05-06 14:06

  本文關(guān)鍵詞:微囊藻毒素-LR長時(shí)期低劑量暴露對(duì)雌性小鼠生殖功能的影響及其機(jī)制研究,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。


【摘要】:微囊藻毒素(Microcystins, MCs)是一類由富營養(yǎng)化淡水藍(lán)藻產(chǎn)生的單環(huán)七肽天然毒素。MC-LR是MCs家族中分布最廣且毒性最強(qiáng)的一種異構(gòu)體。隨著世界水體污染日益加重,藍(lán)藻水華的暴發(fā)日趨普遍,MCs污染已成為全球亟待關(guān)注的環(huán)境問題。近年來,我國生態(tài)系統(tǒng)退化,湖泊、水庫水體富營養(yǎng)化呈現(xiàn)快速發(fā)展的趨勢(shì),在藍(lán)藻水華的高發(fā)季,檢測(cè)到我國太湖水域水體中MCs含量最高值達(dá)到54.897μg/L,約為WHO 1998年規(guī)定的安全限值1μg/L的55倍。研究證明MCs對(duì)肝、腎、神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道等有毒性作用,本實(shí)驗(yàn)室通過急性動(dòng)物實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)MC-LR對(duì)雌性生殖系統(tǒng)有很強(qiáng)的毒性作用,可造成卵巢重量下降,雌激素和孕酮水平下降,動(dòng)情周期紊亂,各級(jí)卵泡數(shù)目發(fā)生變化,卵巢組織結(jié)構(gòu)受損。因日常生活飲水是人群的主要暴露途徑,而研究長期低劑量暴露MC-LR的影響來模擬自然環(huán)境中MCs的毒性效應(yīng)是很有必要的,并且由于雌性生殖系統(tǒng)具有復(fù)雜的解剖結(jié)構(gòu)和生殖周期,系統(tǒng)全面的MC-LR雌性生殖毒性研究鮮有報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)以小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,以WHO規(guī)定生活飲用水中MC-LR限值1μ/L為參照,采取自然飲水的暴露方式進(jìn)行長期低劑量染毒,研究MC-LR對(duì)雌性生殖功能的影響。另外,本實(shí)驗(yàn)室率先發(fā)現(xiàn),MC-LR能進(jìn)入卵巢組織,引起卵巢顆粒細(xì)胞凋亡,提示卵巢顆粒細(xì)胞是MC-LR雌性生殖毒性的重要靶細(xì)胞�;诖�,我們以卵巢顆粒細(xì)胞為研究對(duì)象,通過體外實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步探討MC-LR雌性生殖毒性的作用機(jī)制。第一部分長時(shí)期低劑量暴露MC-LI對(duì)雌性小鼠生殖系統(tǒng)的影響一、目的通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn),研究長期低劑量暴露MC-LR對(duì)雌性小鼠生殖系統(tǒng)的影響二、方法1、160只3周齡雌性BALB/c小鼠(10g左右)隨機(jī)分為2大組:3個(gè)月組和6個(gè)月組,每個(gè)組分為4個(gè)小組:1個(gè)對(duì)照組和3個(gè)實(shí)驗(yàn)組,每組20只小鼠。實(shí)驗(yàn)組中,小鼠喂含MC-LR濃度分別為1μg/L、3.2gg/L和10μg/L的飲用水;對(duì)照組中,小鼠喂不含MC-LR的正常飲用水。分別飼養(yǎng)3個(gè)月和6個(gè)月后,均在小鼠動(dòng)情前期處理,眼球取血,而后斷頸處死,取卵巢等臟器備用。2、常規(guī)方法稱小鼠體重、卵巢濕重和飲水量;陰道涂片觀察小鼠動(dòng)情周期的變化;酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定血清中生殖內(nèi)分泌激素:雌激素(Estradiol, E2)和孕激素(Progesterone, P4)水平,放免法檢測(cè)黃體生成素(Luteinizing Hormone,LH)和卵泡刺激素(Follicle Stimulating Hormone, FSH)的水平;制作卵巢石蠟切片,連續(xù)切片并HE染色,光學(xué)顯微鏡下拍照,計(jì)數(shù)各級(jí)卵泡的變化;TUNEL檢測(cè)卵巢組織凋亡情況;繁殖實(shí)驗(yàn)觀察小鼠產(chǎn)仔情況。三、結(jié)果1, MC-LR染毒3個(gè)月組,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比體重凈增長量、飲水量、LH和產(chǎn)仔率沒有明顯變化,P4水平上升趨勢(shì)極顯著(P0.01)且有時(shí)間-劑量依賴效應(yīng);卵巢閉鎖卵泡數(shù)目顯著上升趨勢(shì)(P0.05);MC-LR 10μg/L組小鼠血清E2水平呈現(xiàn)下降趨勢(shì),卵巢系數(shù)顯著降低(P0.05)、FSH水平顯著上升(P0.05);3.2μgL和10μg/L組小鼠產(chǎn)仔死亡率、動(dòng)情間期時(shí)長呈上升趨勢(shì),動(dòng)情期時(shí)長顯著減少(P0.05),動(dòng)情后期時(shí)長顯著增加(P0.05);TUNEL檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高濃度組卵巢組織凋亡略有增加。2, MC-LR染毒6個(gè)月組,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比體重凈增長量、飲水量沒有明顯變化,卵巢系數(shù)、動(dòng)情期時(shí)長、產(chǎn)仔率降低趨勢(shì)顯著(P0.05),動(dòng)情間期時(shí)長、閉鎖卵泡上升趨勢(shì)顯著(P0.05);MC-LR 10μg/L組FSH水平、產(chǎn)仔死亡率顯著上升(P0.05),P4水平極顯著上升(P0.01);3.2μg/L組LH水平顯著上升(P0.05);10 μg/L和3.2 μg/L組E2水平顯著下降(P0.05);TUNEL檢測(cè)發(fā)現(xiàn)3.2μg/L和10μg/L組卵巢組織凋亡顯著增加(P0.05)。四、結(jié)論1、長時(shí)期低劑量自然飲水染毒MC-LI對(duì)雌性小鼠基本生理指標(biāo)沒有顯著影響。2、MC-LR可使卵巢組織重量減輕,即MC-LR可能影響卵巢組織的生長發(fā)育。3、MC-LR能引起卵巢組織閉鎖卵泡顯著增加。4、MC-LR能干擾雌激素和孕激素的合成,降低小鼠血清E2水平,升高P4水平。5、MC-LR能引起雌性小鼠動(dòng)情周期紊亂,使動(dòng)情期縮短,動(dòng)情后期和動(dòng)情間期延長,進(jìn)而延長動(dòng)情周期時(shí)長。6、MC-LR能引起雌性小鼠產(chǎn)仔率降低,鼠仔死亡率增加。7、MC-LR可使卵巢組織結(jié)構(gòu)損壞,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。第二部分MC-LR對(duì)原代培養(yǎng)的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的毒性作用一、目的通過體外實(shí)驗(yàn),研究MC-LR對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的毒性作用,初步探討MC-LR對(duì)雌性生殖系統(tǒng)的毒性作用機(jī)制。二、方法1、改良顆粒細(xì)胞提取方法,在解剖顯微鏡下取21天BALB/c小鼠卵巢,并用lml注射器機(jī)械法刺破卵泡,反復(fù)輕輕吹打,過濾得到卵巢顆粒細(xì)胞。培養(yǎng)24h后,換液,繼續(xù)培養(yǎng)48h后即得到純度較高的卵巢顆粒細(xì)胞。2、形態(tài)學(xué)觀察,在倒置相差顯微鏡下觀察顆粒細(xì)胞的生長行為和形態(tài)特征。3、利用CCK-8法繪制顆粒細(xì)胞的增殖曲線。4、利用免疫熒光法鑒定卵巢顆粒細(xì)胞的純度。5、卵巢顆粒細(xì)胞分為5個(gè)MC-LR濃度組檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo),即0、0.05μM、0.5μM、5μM、50 μM。6、利用免疫熒光法檢測(cè)MC-LR是否進(jìn)入卵巢顆粒細(xì)胞。7、利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力,MDA、CAT、SOD試劑盒檢測(cè)MC-LR對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響,LDH試劑盒來檢測(cè)MC-LR對(duì)細(xì)胞膜完整性的影響。8、采用Annexin V/PI雙染色法和TUNEL法檢測(cè)MC-LR對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的影響。三、結(jié)果1、倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果表明,剛分離的卵巢顆粒細(xì)胞為球形,大小均一。12h細(xì)胞開始貼壁,細(xì)胞較小,24h后細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,呈梭形或多角形,有聚集生長的現(xiàn)象。72h顆粒細(xì)胞可完全鋪滿皿底,形成單層顆粒細(xì)胞。2、通過檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞在培養(yǎng)初期隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而增殖,24 h和48h時(shí)OD值不斷增高,72 h時(shí)細(xì)胞生長極度旺盛,OD值達(dá)到峰值。3、通過免疫熒光法發(fā)現(xiàn)所得卵巢顆粒細(xì)胞純度較高,且MC-LR能進(jìn)入卵巢顆粒細(xì)胞。4、MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn):染毒MC-LR24h后,細(xì)胞活力在5μM顯著降低(P0.05),在50μM極顯著降低(P0.01);染毒MC-LR48h后,顆粒細(xì)胞活力在5gM和50μM極顯著降低(P0.01)。5、MDA、CAT、SOD試劑盒檢測(cè)MC-LR對(duì)細(xì)胞氧化壓力毒性影響發(fā)現(xiàn):染毒MC-LR24h后,MDA水平在實(shí)驗(yàn)組(0.05、0.5、5、50μM)均顯著升高(P0.05);染毒MC-LR 48h后,MDA水平在0.5gM顯著升高(P0.05),在5gM和50μM極顯著升高(P0.01)。染毒MC-LR24h后,SOD水平先升高后降低,在0.05μM顯著升高(P0.05),在50μM極顯著降低(P0.01);染毒MC-LR48h后,SOD水平在0.5μM顯著降低(P0.05),在5μM和50μM極顯著降低(P0.01)。染毒MC-LR 24h后,CAT水平在50μM顯著降低(P0.05);染毒MC-LR48 h后,CAT水平在5μM和50μM顯著降低(P0.05)。6、LDH試劑盒來檢測(cè)MC-LR對(duì)細(xì)胞膜完整性的毒性影響發(fā)現(xiàn):染毒MC-LR24h后,LDH釋放率有升高的趨勢(shì),與對(duì)照組相比沒有顯著差異;染毒MC-LR48 h后,LDH釋放率在實(shí)驗(yàn)組(0.05、0.5、5、50μM)均顯著升高(P0.05)。7、Annexin V/PI結(jié)果顯示染毒MC-LR24h后,細(xì)胞的凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)有升高的趨勢(shì),在50μM顯著升高(P0.05)。8、TUNEL結(jié)果顯示染毒MC-LR24h后細(xì)胞凋亡率在0.5μM顯著升高(P0.05),在5μM和50μ.M極顯著升高(P0.01):染毒MC-LR 48h后細(xì)胞凋亡率在實(shí)驗(yàn)組(0.05、0.5、5、50μM)均極顯著升高(P0.01)。四、結(jié)論1、在體外培養(yǎng)的條件下,能獲得高純度的卵巢顆粒細(xì)胞。2、MC-LR能夠進(jìn)入卵巢顆粒細(xì)胞。3、MC-LR能使卵巢顆粒細(xì)胞活力下降。4、MC-LR能誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激,導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷,破壞細(xì)胞膜的完整性,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】:長時(shí)期低劑量 微囊藻毒素 雌性生殖 顆粒細(xì)胞 氧化損傷 凋亡
【學(xué)位授予單位】:南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2014
【分類號(hào)】:R114
【目錄】:
  • 中文摘要7-12
  • 英文摘要12-18
  • 前言18-20
  • 第一部分 長時(shí)期低劑量微囊藻毒素對(duì)雌性小鼠生殖功能的影響20-36
  • 一、材料與方法21-28
  • 1、儀器與試劑21
  • 2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物21-22
  • 3、實(shí)驗(yàn)方法22-28
  • 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-33
  • 1、MC-LR對(duì)小鼠體重凈增長量、卵巢指數(shù)和飲水量的影響28
  • 2、MC-LR對(duì)小鼠血清生殖內(nèi)分泌激素水平的影響28-29
  • 3、MC-LR對(duì)小鼠動(dòng)情周期的影響29-30
  • 4、MC-LR隊(duì)小鼠卵巢各級(jí)卵泡數(shù)目的影響30-31
  • 5、MC-LR對(duì)小鼠生育能力的影響31
  • 6、MC-LR對(duì)小鼠卵巢細(xì)胞凋亡情況的影響31-33
  • 三、討論33-36
  • 1、MC-LR對(duì)小鼠體重凈增長量、卵巢相對(duì)重量和飲水量的影響33
  • 2、MC-LR對(duì)小鼠血清生殖內(nèi)分泌激素水平的影響33-34
  • 3、MC-LR對(duì)小鼠動(dòng)情周期的影響34
  • 4、MC-LR對(duì)小鼠卵巢各級(jí)卵泡數(shù)目的影響34-35
  • 5、MC-LR對(duì)小鼠生育能力的影響35
  • 6、MC-LR對(duì)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況的影響35-36
  • 第二部分 MC-LR對(duì)原代培養(yǎng)的卵巢顆粒細(xì)胞的影響36-55
  • 一、材料與方法37-46
  • 1、儀器與試劑37-38
  • 2、試驗(yàn)方法38-46
  • 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-53
  • 1、小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的提取、培養(yǎng)和鑒定46-47
  • 1.1、卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)觀察46
  • 1.2、卵巢顆粒細(xì)胞純度的鑒定46-47
  • 1.3、顆粒細(xì)胞細(xì)胞生長曲線47
  • 2、MC-LR進(jìn)入卵巢顆粒細(xì)胞的驗(yàn)證47-48
  • 3、MC-LR對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的毒性損傷48-51
  • 3.1、MC-LR對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞活力的影響48-49
  • 3.2、MC-LR對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞MDA的影響49
  • 3.3、MC-LR對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞SOD的影響49-50
  • 3.4、MC-LR對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞CAT的影響50
  • 3.5、MC-LR對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞膜完整性的作用50-51
  • 4、MC-LR對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響51-53
  • 4.1、TUNEL法檢測(cè)MC-LR對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響51-52
  • 4.2、流式法檢測(cè)MC-LR對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響52-53
  • 三、討論53-55
  • 1、卵巢顆粒細(xì)胞的基本狀態(tài)53
  • 2、MC-LR對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用53-55
  • 2.1、氧化應(yīng)激53-54
  • 2.2、凋亡54-55
  • 全文總結(jié)55-56
  • 文獻(xiàn)綜述56-61
  • 參考文獻(xiàn)61-68
  • 在讀期間已(待)發(fā)表的論文68-69
  • 英文縮略詞表69-70
  • 致謝70-71

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3 孫美艷;鈣激活氯離子通道ANO1在卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)與功能[D];吉林大學(xué);2014年

4 夏天;補(bǔ)腎調(diào)沖方對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖與分泌及其相關(guān)基因表達(dá)的影響[D];天津中醫(yī)學(xué)院;2005年

5 李沛霖;補(bǔ)腎調(diào)沖含藥血清對(duì)離體大鼠卵巢顆粒細(xì)胞分泌功能與結(jié)構(gòu)的影響[D];天津中醫(yī)學(xué)院;2005年

6 魏兆蓮;二甲雙胍對(duì)PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞胰島素受體底物-1及P450芳香化酶的作用[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2011年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李攀;間充質(zhì)干細(xì)胞來源微囊泡對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的作用及機(jī)制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

2 張永芳;二甲雙胍對(duì)多囊卵巢綜合征卵巢顆粒細(xì)胞胰島素受體底物-1及其磷酸化表達(dá)的影響[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2015年

3 鄒文兵;多種營養(yǎng)素對(duì)燃煤型氟中毒雌鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡干預(yù)作用研究[D];貴陽醫(yī)學(xué)院;2015年

4 唐曉靜;黨參炔苷和木犀草素對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞激素分泌的影響及其作用機(jī)制[D];中央民族大學(xué);2015年

5 雷夢(mèng)媛;FSTL3基因在綿羊常年發(fā)情中的功能研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

6 袁明明;微囊藻毒素-LR長時(shí)期低劑量暴露對(duì)雌性小鼠生殖功能的影響及其機(jī)制研究[D];南京大學(xué);2014年

7 張靜;端粒酶在卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)理的研究[D];江西醫(yī)學(xué)院;2004年

8 凌志杰;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的作用研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2011年

9 尹巧芝;資沖顆粒對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞產(chǎn)生雌激素影響的研究[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2003年

10 楊濤;微囊藻毒素LR致大鼠卵巢顆粒細(xì)胞氧化損傷及機(jī)制探討[D];福建醫(yī)科大學(xué);2011年


  本文關(guān)鍵詞:微囊藻毒素-LR長時(shí)期低劑量暴露對(duì)雌性小鼠生殖功能的影響及其機(jī)制研究,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。



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