發(fā)布時(shí)間：2021-10-29 05:31

　　目的:矽肺是吸入大量游離二氧化硅（SiO₂）引起,以肺部炎癥和晚期纖維化為主的疾病。暴露于SiO₂的成纖維細(xì)胞被激活后,不斷增加和轉(zhuǎn)型為肌成纖維細(xì)胞,分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）。隨著肌成纖維細(xì)胞數(shù)目的不斷增加,肺部的成纖維灶逐漸形成,并且逐漸取代正常的肺細(xì)胞組織,引起肺部結(jié)構(gòu)的異常重塑,進(jìn)而觸發(fā)肺纖維化。盡管肌成纖維細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)型是成纖維細(xì)胞灶的主要來(lái)源,但近年的研究表明,在肺纖維化過(guò)程中部分成纖維細(xì)胞灶的細(xì)胞可能由其它肺部細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái),其中肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分別通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndMT）形成間質(zhì)細(xì)胞（成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞）,被認(rèn)為是纖維化過(guò)程中局部成纖維細(xì)胞的重要來(lái)源之一,但詳細(xì)作用機(jī)制尚不清楚。EndMT被認(rèn)為是EMT的一種特殊形式,在上皮和內(nèi)皮細(xì)胞獲得間質(zhì)特性過(guò)程中發(fā)揮重要作用,是誘導(dǎo)肺纖維化發(fā)生的一種重要來(lái)源。本課題將著重研究circHECTD1/HECTD1參與SiO₂誘導(dǎo)EndMT的過(guò)程和機(jī)制。方法:利用C57BL及STK TEK-GFP 287 Sato/JNj... 

【文章來(lái)源】：東南大學(xué)江蘇省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：70 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

小鼠矽肺模型中發(fā)生EndMT圖A：SiriusRed代表天狼猩紅染色，Tie2-GFP代表內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物，小鼠矽肺模型

結(jié)果整體水平證實(shí) EndMT 現(xiàn)象后，離體水平建立 SiO2暴露模型，并將研究移到 MML1 細(xì)胞上。首先每孔接種 1 ml 的密度為 1×105/ml 的 MML1 細(xì) 孔板內(nèi)，24 h 更換新鮮培養(yǎng)基后每孔分別加入 20 μl 的 SiO2（50 mg/ml）理 0 h、6 h、12 h、24 h、48 h，收取蛋白樣品于-80℃保存，WB 實(shí)驗(yàn)檢中相關(guān)標(biāo)志物的變化。如圖 3.A-D，WB 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SiO2刺激細(xì)胞后志物 COL1A1、COL3A1、Acta 2 的表達(dá)量隨處理時(shí)間延長(zhǎng)呈時(shí)間依賴性增皮細(xì)胞標(biāo)志物 Cdh 5、PECAM 1 的表達(dá)量呈時(shí)間依賴性降低，提示 SiO2ML1 細(xì)胞獲得間質(zhì)特性。細(xì)胞免疫組化對(duì)上述 WB 結(jié)果進(jìn)行輔助證明， 結(jié)果顯示，SiO2模型組與 PBS 組相比，內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物 PECAM 1 表低，間質(zhì)的標(biāo)志物 Acta 2 的表達(dá)量增加，且 PECAM 1 與 Acta 2 出現(xiàn)共定，更進(jìn)一步證實(shí)了 SiO2在體外誘導(dǎo) EndMT 的發(fā)生。

4.3 HECTD1 參與 SiO2誘導(dǎo)的 EndMT前期我們?cè)谔骄?EndMT 時(shí)，發(fā)現(xiàn)一種去泛素化酶 MCPIP1 在其中發(fā)揮著重要作用，這提示泛素化相關(guān)蛋白可能參與間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。一方面 HECTD1 作為一種 E3 泛素連接酶與 MCPIP1 功能具有相關(guān)性；另一方面 HECTD1 不僅決定靶蛋白特異性，在泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中也發(fā)揮著重要作用，參與細(xì)胞動(dòng)態(tài)的調(diào)節(jié)。因此，本課題選定 HECTD1 為目標(biāo)蛋白，探究 SiO2誘導(dǎo) EndMT 發(fā)生的具體分子機(jī)制。首先探究 SiO2是否影響 HECTD1 的表達(dá)，如圖 5.A-B，WB 結(jié)果表明，MML1 細(xì)胞 SiO2暴露模型下 HECTD1 的表達(dá)受抑制且抑制效應(yīng)隨 SiO2處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈時(shí)間依賴性增加，并在 48 h 時(shí)抑制達(dá)到最顯著效果，提示 SiO2刺激內(nèi)皮細(xì)胞后 HECTD1 的表達(dá)受抑制。為了探究 HECTD1 的表達(dá)變化是否與EndMT 的發(fā)生相關(guān)，利用 CRISPER/Cas9 技術(shù)過(guò)表達(dá) HECTD1，圖 5.C-D 為 WB實(shí)驗(yàn)觀察到過(guò)表達(dá) HECTD1 成功的結(jié)果。


本文編號(hào)：3464059