本文關(guān)鍵詞：2007-2013年廣東省腹瀉病例副溶血弧菌分離株的病原特征分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景；副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus,VP)又名致病性嗜鹽菌,是一種革蘭氏陰性細(xì)菌,廣泛存在于河口、海洋和海岸環(huán)境中。副溶血弧菌是一種海產(chǎn)源性的致病菌,感染的主要途徑是由于食用了未煮熟的受污染的海產(chǎn)品,尤其是貝類(lèi)。在世界范圍內(nèi),副溶血弧菌是引起旅行者腹瀉和腸胃炎的主要原因。廣東省地處沿海,海產(chǎn)品消費(fèi)量較大,因此副溶血弧菌對(duì)公共衛(wèi)生及商業(yè)效益所造成的影響也不容忽視。現(xiàn)根據(jù)菌體O抗原和莢膜K抗原的不同,可分為13個(gè)熱穩(wěn)定O抗原群(01～013),71種熱不穩(wěn)定K抗原(K1～K71),但也存在許多不能被血清分型的菌株。副溶血弧菌主要分為兩類(lèi),一類(lèi)是非致病性的副溶血弧菌,另一類(lèi)是致病性的副溶血弧菌。幾乎所有的環(huán)境分離株都是非致病性的,而臨床患者的分離株則是致病性的。副溶血弧菌本身具有多種致病的毒力因子,目前認(rèn)為它主要的致病因子有：耐熱直接溶血毒素(TDH)、耐熱相關(guān)溶血毒素(TRH)、尿素酶、毒力島和Ⅲ型分泌系統(tǒng)。新的03：K6型副溶血弧菌首先于1996年在印度的加爾各答(Calcutt a)地區(qū)得到分離和鑒定。在隨后幾個(gè)月的副溶血弧菌感染病例中,此血清型占到了50-80%。所有的03：K6型分離株均為tdh+trh-型菌株,并且具有一致的基因型。隨后在印尼、越南、孟加拉國(guó)、日本、韓國(guó)和泰國(guó)等地也發(fā)現(xiàn)了相同血清群的菌株。根據(jù)toxRS位點(diǎn)的核苷酸變異找到了特異性識(shí)別新克隆株的方法,在應(yīng)用這種方法的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)有些分離株即使血清型不同,但都可被歸入“新的”03：K6克隆群中。并在隨后幾年陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了約21種血清型,主要有：O4:K68、O1:K25, O1:K41,和O1:KUT。這些血清型雖然與03：K6型菌株在O、K抗原上有差別,但具有相同的分子特征和基因型,因此將這些菌株統(tǒng)稱(chēng)為“大流行菌群”。到2006年為止,在歐洲、莫桑比克、美國(guó)等地都分離出了03：K6和它的衍生血清型菌株,“大流行菌群”的出現(xiàn)使得副溶血弧菌成為威脅全球公共衛(wèi)生健康的重要致病菌。多位點(diǎn)序列分析(Multilocus Sequence Typing, MLST)是通過(guò)對(duì)所選擇的管家基因來(lái)進(jìn)行序列分析,來(lái)分析菌株的變異情況。這已成為對(duì)細(xì)菌病原體進(jìn)行分子流行病學(xué)和種群遺傳研究的重要工具。MLST是以核苷酸序列為基礎(chǔ),結(jié)果易于確認(rèn)、儲(chǔ)存和通過(guò)網(wǎng)絡(luò)的方式共享,有利于世界各地實(shí)驗(yàn)室之間的相互比較。通過(guò)多位點(diǎn)序列分析研究,可以更好地了解一個(gè)物種內(nèi)各菌株間的基因聯(lián)系,并確定在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮相對(duì)重要的基因重組和橫向轉(zhuǎn)移事件。Gonzalez-Escalona等人在對(duì)全球100株副溶血弧菌菌株進(jìn)行研究后開(kāi)發(fā)了一套成功的針對(duì)副溶血弧菌的MLST實(shí)驗(yàn)方案。本研究通過(guò)對(duì)廣東省2007-2013年腹瀉病例副溶血弧菌分離株的血清型別、毒力基因攜帶情況以及MLST基因分型結(jié)果進(jìn)行分析,以更好地了解副溶血弧菌的種群結(jié)構(gòu)、流行情況、以及種群進(jìn)化關(guān)系,為副溶血弧菌所引發(fā)的食源性疾病的監(jiān)測(cè)和防控提供數(shù)據(jù)支持。研究目的：1.了解廣東省2007-2013年腹瀉病例副溶血弧菌分離株的血清型別和毒力基因的分布情況,掌握副溶血弧菌流行的優(yōu)勢(shì)血清型及致病性副溶血弧菌的分布情況。2.了解廣東省2007-2013年腹瀉病例副溶血弧菌分離株中“大流行菌群”的分布情況,確定廣東地區(qū)是否存在副溶血弧菌的優(yōu)勢(shì)克隆群。3.了解廣東省2007-2013年腹瀉病例副溶血弧菌分離株的種群結(jié)構(gòu)及進(jìn)化關(guān)系。研究方法：1.菌株來(lái)源：本研究所使用的副溶血弧菌菌株均來(lái)源于廣東省疾病預(yù)防控制中心2007-2013年通過(guò)食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)所收集得到的腹瀉病例分離株,共469株。收集范圍涵蓋廣東省內(nèi)15個(gè)地級(jí)市。所有菌株均經(jīng)廣東省疾病預(yù)防控制中心病原微生物檢驗(yàn)所進(jìn)行復(fù)核鑒定后,冷凍干燥保存于-70℃的環(huán)境下。2.血清學(xué)分型：將副溶血弧菌于3% NaCl TSA斜面上37”℃培養(yǎng)24h。挑選菌群,使用副溶血弧菌血清試劑盒進(jìn)行菌體抗原(O)與莢膜抗原(K)的凝集試驗(yàn)。3.毒力基因檢測(cè)：采用PCR擴(kuò)增的方法檢測(cè)tdh和trh、GS-PCR和orf8基因。副溶血弧菌“大流行菌群”的判定標(biāo)準(zhǔn)為：①1996年以后分離；②TDH陽(yáng)性；③TRH陰性；④GS-PCR(group-specific PCR)陽(yáng)性和/或orf8陽(yáng)性。4.MLST：挑取150株具有代表性的菌株對(duì)其7個(gè)管家基因(housekeeping genes, HK genes)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和基因測(cè)序。7個(gè)等位基因分別為：dnaE(編碼DNA聚合酶Ⅲ，α亞基)、recA(編碼RecA蛋白)、gyrB(編碼DNA解旋酶,B亞基)、dtdS(編碼2-氨基-3羥基丁酸脫氫酶)、pntA(編碼轉(zhuǎn)氫酶a亞基)、pyrC(編碼二氫乳清酸)和tnaA(編碼色氨酸酶)。將序列信息上傳至PubMlst網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì),以確認(rèn)等位基因和序列型別(Sequence Types, STs);應(yīng)用eBURST軟件對(duì)菌株的ST型別進(jìn)行分析,確定同源復(fù)合體等信息；應(yīng)用Mega 5.1軟件比對(duì)每個(gè)ST型別所對(duì)應(yīng)的7個(gè)等位基因的連鎖序列構(gòu)建最小進(jìn)化(ME)樹(shù),分析各菌株間的親緣關(guān)系；同時(shí)應(yīng)用START 2軟件分析MLST數(shù)據(jù),計(jì)算dN/dS率、關(guān)聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)化指數(shù)IsA、統(tǒng)計(jì)沉默核苷酸位點(diǎn)的數(shù)目等,以分析各位點(diǎn)核苷酸多樣性和基因重組的情況。結(jié)果：1.血清學(xué)分型：本研究共收集得到廣東省2007-2013年腹瀉病例副溶血弧菌分離株469株,分為7種O抗原血清型,16種K抗原血清型以及24種組合血清型。其中優(yōu)勢(shì)血清型為03：K6型(330株,70.36%),其次為04：K8型(54株,11.51%)和01：KUT型(28株,5.97%)。在本研究中,K抗原不能分型的菌株有44株,而O抗原不能分型的有2株,還發(fā)現(xiàn)了較為特別的O1：K36型菌株,在以往的研究中報(bào)道較少。2.毒力基因攜帶情況：有95.74%(449/469)的副溶血弧菌分離株為tdh+trh-菌株,1.28%(6/469)為tdh-trh+菌株,3株為tdh-trh-菌株,僅2株為tdh+trh+菌株。副溶血弧菌分離株中有64.39%(302/469)攜帶GS-PCR和/或orf8基因。值得注意的是,有8.61%(26/302)僅攜帶orf8基因,而有8.61%(26/302)僅攜帶GS-PCR基因,以上兩種菌株均缺失了其中一種標(biāo)識(shí)。3.“大流行菌群”分布情況：根據(jù)副溶血弧菌“大流行菌群”的判定標(biāo)準(zhǔn),共有63.75%(299/469)的菌株被判定為“大流行菌群”,包括7種血清型：03：K6型、04：K8型、O1：KUT型、O1：K38型、03：K29型、04：K68型和05：K68型,其中,03：K6型的分離株最多。4.MLST結(jié)果①等位基因型及核苷酸多態(tài)性情況：7個(gè)管家基因的等位基因數(shù)從16(pntA)到20(gyrB)不等。各管家基因的核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)在23(dnaE)到161(recA)之間浮動(dòng)。每個(gè)管家基因位點(diǎn)出現(xiàn)頻率最高的等位基因分別是：dnaE-3(96株),gyrB-4(101株),recA-19(95株),dtdS-4(95株),pntA-29(94株),pyrC-4(94株)以及tnaA-22(95株)。在dnaE、recA、pntA、pyrC和tnaA四個(gè)基因中,dN/dS率(非同義變異與同義變異的比率),均小于1,而在gyrB和dtdS基因中值為0。7個(gè)管家基因的平均G+C含量在43.92%(pntA)到50.27%(dtdS)之間浮動(dòng),與副溶血弧菌本身的45.4%G+C含量接近。②ST型分布情況：150株副溶血弧菌分離株共被分為30個(gè)不同的ST型別,其中有3個(gè)ST型為首次發(fā)現(xiàn),之前在數(shù)據(jù)庫(kù)中并未出現(xiàn)過(guò),分別為：ST-1117、ST-1118和ST-1119型。21個(gè)ST型只有一株分離株,而剩下的7個(gè)ST型分別包括了2到89株不等的分離株。而本研究中出現(xiàn)頻率最高的ST型為ST-3型(89株,59.33%),主要由03：K6型菌株組成(79株,88.76%)。③同源復(fù)合體：通過(guò)eBURST軟件的分析,30個(gè)ST型別被分為：1個(gè)同源復(fù)合體(Clonal Complex, CC)CC3,3個(gè)雙聯(lián)體(Doublets, D)D1、D2和D3,以及19個(gè)獨(dú)特型(Singletons, S)。CC3共包括95株分離株,涵蓋5個(gè)ST型(ST-3、ST-431、ST-661、ST-435和ST-787),其中ST3型被定義為該同源復(fù)合體的始祖序列型(ancestral type or founder)。④集群與系統(tǒng)發(fā)育分析：ME進(jìn)化樹(shù)(minimum evolution tree)是由30個(gè)ST型的7個(gè)管家基因的串聯(lián)序列構(gòu)建而成。在本研究中,ME樹(shù)主要包括兩個(gè)部分,它們之間的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。eBURST與ME進(jìn)化樹(shù)的分析結(jié)果基本一致,但雙聯(lián)體D1中的ST-189和ST-265由于其在recA位點(diǎn)上的差異,被分成了單獨(dú)的兩部分,還將一些獨(dú)特型分在了同一簇群中建立了進(jìn)化關(guān)系。與eBURST相比,ME進(jìn)化樹(shù)具有更好的分辨力,能夠揭示一些eBURST未能發(fā)現(xiàn)的群組或獨(dú)特型之間的進(jìn)化發(fā)育關(guān)系。⑤基因重組情況：運(yùn)用START2軟件,對(duì)7個(gè)管家基因的DNA序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)recA基因的沉默多態(tài)位點(diǎn)數(shù)目多達(dá)126個(gè),顯著高于其他管家基因。在對(duì)7個(gè)管家基因進(jìn)行連鎖平衡的分析時(shí),得到的關(guān)聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)化指數(shù)IsA=0.9024(p0.05),表明7個(gè)管基因之間存在顯著的連鎖不平衡現(xiàn)象。而排除“大流行菌群”分離株后,再次進(jìn)行計(jì)算,得到的關(guān)聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)化指數(shù)IsA＝0.8063(p0.05),較150株的關(guān)聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)化指數(shù)有所下降。結(jié)論：1.廣東省2007-2013年間的腹瀉病例副溶血弧菌優(yōu)勢(shì)血清型為03：K6型,絕大部分腹瀉病例分離株為致病性副溶血弧菌。2.廣東省2007-2013年間由副溶血弧菌“大流行菌群”感染所引起的腹瀉病例在副溶血弧菌感染中所占的比重超過(guò)50%,表明在廣東省,“大流行菌群”仍然為優(yōu)勢(shì)流行克隆群,因此要加強(qiáng)對(duì)“大流行菌群”生長(zhǎng)環(huán)境及傳播途徑的研究,以便更好地應(yīng)對(duì)副溶血弧菌所引發(fā)的食源性疾病。3.廣東省2007-2013年間僅鑒定出1個(gè)副溶血弧菌同源復(fù)合體,為CC3,其始祖序列型為ST-3。同源復(fù)合體CC3包含了大部分被鑒定為“大流行菌群”的分離株,但有少部分歸入了其他ST型中。4.廣東省副溶血弧菌存在基因重組現(xiàn)象,尤其是在recA基因位點(diǎn)。recA位點(diǎn)頻繁發(fā)生的基因重組現(xiàn)象,可能使其在MLST分析中不再是一個(gè)理想的基因標(biāo)記物。
【關(guān)鍵詞】：腹瀉 副溶血弧菌 大流行菌群 多位點(diǎn)序列分析 MLST 基因重組
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R155.3;R446.5
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 第一章 前言18-30
• 一. 副溶血弧菌的病原學(xué)特征18-22
• 二. 副溶血弧菌的流行概況22-23
• 三. 副溶血弧菌“大流行菌群”23-25
• 四. 副溶血弧菌的分型25-28
• 五. 研究的意義28-30
• 第二章 廣東省腹瀉病例副溶血弧菌分離株血清型及毒力基因攜帶情況的研究30-46
• 實(shí)驗(yàn)材料和方法30-35
• 結(jié)果35-42
• 討論42-46
• 第三章 廣東省腹瀉病例副溶血弧菌分離株的多位點(diǎn)序列分析(MLST)研究46-68
• 實(shí)驗(yàn)材料和方法46-53
• 結(jié)果53-61
• 討論61-68
• 全文小結(jié)68-70
• 參考文獻(xiàn)70-80
• 主要英文縮略詞表80-81
• 附錄81-102
• 碩士期間論文發(fā)表的情況102-103
• 致謝103-105

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 李劍森;梁駿華;柯碧霞;盧玲玲;何冬梅;鄧小玲;柯昌文;黃蔚;黃熙;李世聰;黃瓊;;2012年廣東省食源性疾病監(jiān)測(cè)結(jié)果分析[J];華南預(yù)防醫(yī)學(xué);2013年06期

2 毛雪丹;胡俊峰;劉秀梅;;2003-2007年中國(guó)1060起細(xì)菌性食源性疾病流行病學(xué)特征分析[J];中國(guó)食品衛(wèi)生雜志;2010年03期

  本文關(guān)鍵詞：2007-2013年廣東省腹瀉病例副溶血弧菌分離株的病原特征分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：345770