發(fā)布時間：2017-05-03 03:09

  本文關(guān)鍵詞：EGCG對慢性鉛暴露大鼠海馬突觸形成的影響及可能機(jī)理，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：正常的大腦神經(jīng)活動依賴于神經(jīng)環(huán)路興奮性與抑制性突觸的平衡。鉛是一種重要的環(huán)境毒和神經(jīng)毒性物質(zhì),可致大腦發(fā)育和功能損傷。近年來研究顯示鉛是興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體NMDAR(N-甲基-D-天門冬氨酸)的一種拮抗劑,但是鉛對神經(jīng)環(huán)路抑制性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性突觸的影響尚不明確。表沒食子兒茶素沒食子酸(Epigallo-catechin-3-gallate, EGCG)是綠茶中一種重要的多酚類物質(zhì),具有高效清除自由基的作用,已往研究表明EGCG能明顯改善鉛暴露大鼠海馬的氧化應(yīng)激參數(shù),且能部分修復(fù)鉛暴露引起的大鼠海馬學(xué)習(xí)記憶LTP的損傷。但EGCG能否通過調(diào)節(jié)神經(jīng)活動的最基本機(jī)構(gòu)—--突觸的生成以及能否通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路從而實(shí)現(xiàn)其對鉛中毒的保護(hù)作用,目前尚不清楚。本研究鉛暴露對海馬神經(jīng)元興奮性突觸和抑制性突觸以及對樹突棘形態(tài)的影響,并探討EGCG對慢性鉛暴露海馬神經(jīng)元突觸生成損傷的修復(fù)作用及其機(jī)理。 本課題研究取新生大鼠(出生后24 h內(nèi),P0)海馬組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),體外培養(yǎng)第7天開始加入醋酸鉛(1μM)處理至實(shí)驗(yàn)終末(DIV12),并在第10天給予EGCG (50 μM)處理48 h,觀察樹突棘的變化,進(jìn)行電生理、免疫細(xì)胞化學(xué)、Western Blot和生物素酰化實(shí)驗(yàn)。整體動物實(shí)驗(yàn)以Sprague-Dawley (SD)母鼠喂飼300ppm醋酸鉛水溶液,幼鼠自出生后至斷奶(出生后第21天)經(jīng)母乳鉛暴露。幼鼠自從出生后第14天到21天經(jīng)腹腔注射給藥：EGCG (10,25和50mg/kg)。取海馬腦組織,切片,Golgi-cox染色觀察樹突棘形態(tài)；海馬組織鉛含量測定；Western Blot檢測Wnt7a、β-catenin和phospho-p-catenin蛋白的表達(dá)；PCR檢測Wnt7a基因的表達(dá)；對原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt7a shRNA,觀察樹突棘的變化。研究結(jié)果如下：1、離體培養(yǎng)海馬神經(jīng)元,1μM的鉛可以引起海馬神經(jīng)元樹突棘密度顯著降低,鉛暴露增加了mIPSC的頻率,對mIPSC的幅度、mEPSC的頻率和幅度都無顯著影響；免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)表明：鉛暴露使氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白vGAT顯著增加,而對抑制性突觸的突觸后蛋白Gephyrin,谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白vGlut和突觸后致密物PSD95無顯著影響。2、鉛暴露使Gama氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白vGAT顯著增加,我們進(jìn)一步研究了探究GABA的合成和突觸后膜GABAA受體的變化。結(jié)果表明：鉛暴露顯著增加海馬神經(jīng)元GAD65和突觸后膜表面GABAAβ2/3受體的表達(dá)。3、不同劑量EGCG (10、25、50 mg/kg)處理,鉛暴露大鼠海馬神經(jīng)元樹突棘的密度和頭部大小都有顯著性增加,并且表現(xiàn)出一定的濃度依賴性,即高濃度的EGCG(50mg/kg)對神經(jīng)元具有損傷作用。鉛暴露顯著降低Wnt7a, β-catenin的表達(dá),但β-catenin磷酸化水平升高。EGCG (10、25 mg/kg)能夠顯著上調(diào)Wnt7a的表達(dá),同時使β-catenin的磷酸化水平降低。海馬神經(jīng)元轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt7ashRNA, EGCG增加鉛暴露海馬神經(jīng)元樹突棘密度的功能被抑制,即EGCG可能通過調(diào)節(jié)Wnt7a/β-catenin通路信號的表達(dá)來修復(fù)鉛暴露引起的突觸形成的損傷。綜上所述,鉛暴露增加了海馬抑制性神經(jīng)遞質(zhì)合成和轉(zhuǎn)運(yùn)從而對興奮性突觸傳遞產(chǎn)生去抑制,損傷了海馬神經(jīng)元興奮性和抑制性的平衡。EGCG通過上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路,對鉛暴露大鼠樹突棘形成的損傷有一定的修復(fù)作用。
【關(guān)鍵詞】：鉛 GABA Wnt/β-catenin通路 樹突棘 EGCG
【學(xué)位授予單位】：合肥工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R114
【目錄】：

• 致謝7-8
• 摘要8-10
• Abstract10-17
• 第一章 緒論17-25
• 1.1 鉛的神經(jīng)毒性17-18
• 1.2 海馬、突觸與學(xué)習(xí)記憶18-19
• 1.3 樹突棘的研究19
• 1.4 興奮性和抑制性突觸的平衡19-20
• 1.5 鉛中毒的防治20-21
• 1.6 EGCG的研究進(jìn)展21-22
• 1.7 Wnt通路22-24
• 1.8 課題研究的內(nèi)容24-25
• 第二章 鉛暴露對大鼠海馬神經(jīng)元突觸形成的影響25-41
• 2.1 材料與方法25-34
• 2.1.1 主要儀器耗材25
• 2.1.2 主要試劑25
• 2.1.3 海馬神經(jīng)元培養(yǎng)25-26
• 2.1.4 電生理實(shí)驗(yàn)26-28
• 2.1.4.1 主要儀器26
• 2.1.4.2 主要試劑和藥品26-27
• 2.1.4.3 電生理實(shí)驗(yàn)步驟27-28
• 2.1.5 細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)28-29
• 2.1.5.1 試劑和藥品28
• 2.1.5.2 實(shí)驗(yàn)步驟28-29
• 2.1.5.3 圖像分析29
• 2.1.6 Western Blot實(shí)驗(yàn)29-33
• 2.1.6.1 主要儀器29
• 2.1.6.2 主要試劑和藥品29
• 2.1.6.3 主要抗體29
• 2.1.6.4 海馬組織蛋白的提取29-30
• 2.1.6.5 海馬組織蛋白濃度的測定及蛋白樣品的準(zhǔn)備30-31
• 2.1.6.6 Western Blot所需溶液配制31-32
• 2.1.6.7 Western Blot實(shí)驗(yàn)步驟32-33
• 2.1.7 細(xì)胞表面生物素�；�33-34
• 2.1.7.1 試劑33
• 2.1.7.2 實(shí)驗(yàn)步驟33-34
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-38
• 2.2.1 鉛暴露對海馬神經(jīng)元樹突棘的影響34
• 2.2.2 鉛暴露對海馬神經(jīng)元突觸傳遞功能的影響34-35
• 2.2.3 鉛暴露對海馬神經(jīng)元興奮性突觸與抑制性突觸數(shù)目的影響35-36
• 2.2.4 鉛暴露對抑制性突觸GABA合成酶GAD65的影響36-37
• 2.2.5 鉛暴露對抑制性突觸GABA_A受體的影響37-38
• 2.3 討論38-41
• 第三章 EGCG對鉛暴露大鼠突觸形成損傷的修復(fù)作用41-57
• 3.1 材料與方法41-48
• 3.1.1 主要儀器41
• 3.1.2 藥物及試劑41
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)動物41
• 3.1.4 海馬組織鉛含量測定41-42
• 3.1.5 Golgi-cox染色,樹突棘形態(tài)分析42
• 3.1.6 Western Blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)42-43
• 3.1.6.1 主要儀器,主要試劑和藥品(同第二部分)42-43
• 3.1.6.2 主要抗體43
• 3.1.6.3 Western Blot蛋白定量分析(同第二部分)43
• 3.1.7 RT-PCR表達(dá)檢測43-46
• 3.1.7.1 材料43
• 3.1.7.2 海馬組織中總量RNA的提取43-44
• 3.1.7.3 RNA濃度的測定44
• 3.1.7.4 反轉(zhuǎn)錄44
• 3.1.7.5 引物設(shè)計(jì)44-45
• 3.1.7.6 緩沖液配制45
• 3.1.7.7 瓊脂糖凝膠配制45
• 3.1.7.8 RT-PCR檢測45-46
• 3.1.8 海馬神經(jīng)元培養(yǎng)(同第二章)46-48
• 3.1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析48
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果48-55
• 3.2.1 大鼠海馬組織鉛含量測定48-49
• 3.2.2 鉛暴露和EGCG對樹突棘密度的影響49-50
• 3.2.3 鉛暴露和EGCG對樹突棘頭部形態(tài)的影響50
• 3.2.4 鉛暴露和EGCG對Wnt7a蛋白表達(dá)水平的影響50-51
• 3.2.5 鉛暴露和EGCG對Wnt7a mRNA水平的影響51-52
• 3.2.6 鉛暴露和EGCG對Wnt通路β-catenin磷酸化水平的影響52-53
• 3.2.7 EGCG對鉛暴露海馬神經(jīng)元Wnt7a和β-catenin的影響53-54
• 3.2.8 鉛暴露海馬神經(jīng)元轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt7ashRNA,EGCG對樹突棘的影響54-55
• 3.3 討論55-57
• 參考文獻(xiàn)57-66
• 攻讀碩士學(xué)位期間的學(xué)術(shù)活動及成果情況66-67

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本文編號：342208