多溴聯(lián)苯醚（PBDEs）作為一種阻燃劑被廣泛應(yīng)用于商業(yè)和家庭用品等各個領(lǐng)域。然而,PBDEs化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、不易降解、且具有生物蓄積性,能夠長期存在于環(huán)境和生物體中,對人類生存環(huán)境和生命健康造成極大的威脅。在生物體內(nèi),PBDEs可能發(fā)生生物轉(zhuǎn)化,產(chǎn)生相應(yīng)的羥基代謝物（OH-PBDEs）,進一步還可氧化生成多溴聯(lián)苯醌（PBDEQ）,這些代謝物與母體相比具有相似或更高的毒性。多溴聯(lián)苯醌（PBDEQ）作為PBDEs的醌類代謝產(chǎn)物,在生物體內(nèi)很容易與DNA、蛋白質(zhì)、親核試劑發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)。此外,PBDEQ在與對苯二酚-半醌-醌的氧化還原過程中還能產(chǎn)生半醌自由基或活性氧（ROS）,引起氧化應(yīng)激反應(yīng),進一步誘導(dǎo)細(xì)胞毒性,對生物體造成神經(jīng)毒性、免疫毒性、生殖毒性以及致癌等作用。第一部分:該部分旨在研究PBDEQ能誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞（BV2）發(fā)生細(xì)胞自噬。首先,我們檢測了PBDEQ在不同濃度和不同時間作用下的細(xì)胞毒性,通過CCK-8實驗發(fā)現(xiàn)PBDEQ引起B(yǎng)V2細(xì)胞存活率呈濃度和時間依賴性降低。接著,我們考察了PBDEQ是否能夠引起細(xì)胞自噬。利用Western Blot實驗檢測了細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3B、... 

【文章來源】：西南大學(xué)重慶市 211工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：碩士

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4-二溴聯(lián)苯醌結(jié)構(gòu)式

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文18活率<80%）的給藥濃度（10μM）、作用時間（24h）來進行后續(xù)實驗。圖2-1PBDEQ對BV2細(xì)胞存活率的影響Fig.2-1EffectofPBDEQonBV2cellviability2.4.2PBDEQ在BV2細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬發(fā)生為了考察PBDEQ能否誘導(dǎo)BV2細(xì)胞自噬活性增強，我們檢測了能夠反映自噬發(fā)生的相關(guān)指標(biāo)。在自噬過程中，非激活型胞質(zhì)LC3B-I經(jīng)過水解和脂質(zhì)化轉(zhuǎn)化成膜結(jié)合形式的LC3B-II，并由最初的分散分布轉(zhuǎn)而定位于新形成的自噬體的內(nèi)膜和外膜上，所以LC3B通常被視作細(xì)胞發(fā)生自噬的標(biāo)志性蛋白85。p62/SQSTM1是一種由應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生并作用于選擇性自噬的多功能蛋白，且p62包含多種蛋白作用域，可結(jié)合聚泛素化蛋白并將其進一步降解，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用86。LC3B和p62的表達(dá)可以反映自噬的強弱。LC3B-II上調(diào)，p62下調(diào)，表明自噬流通暢；而LC3B-II上調(diào)，p62也上調(diào)，表明自噬起始正常，但下游通路被阻斷，自噬體和溶酶體不能融合。如圖2-2（a）所示，通過WesternBlot實驗檢測PBDEQ處理細(xì)胞后LC3B、p62的表達(dá)水平，結(jié)果顯示LC3B-II的轉(zhuǎn)化隨著給藥濃度增加而上調(diào)，p62則呈下調(diào)趨勢。同時，如圖2-2（b），通過免疫熒光實驗觀察LC3B熒光斑點的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，PBDEQ處理組細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯的綠色熒光斑點。初步證明PBDEQ誘導(dǎo)BV2細(xì)胞發(fā)生自噬現(xiàn)象。接下來，為了進一步確自噬現(xiàn)象的發(fā)生，我們使用了熒光染料對自噬體進行標(biāo)記。MDC、AO染色法是常用的酸性細(xì)胞器標(biāo)記技術(shù)。MDC是一種嗜酸性染色劑，可與酸性細(xì)胞器（自噬溶酶體）結(jié)合呈現(xiàn)綠色熒光。AO能透過細(xì)胞膜并嵌入細(xì)胞核與DNA結(jié)合，發(fā)出綠色熒光，也可以進入酸性細(xì)胞器如自噬溶酶體，pH降低時，AO發(fā)出紅色熒光。因此，通過觀察熒光強度即可反映出自噬體形成情況。如圖2-2（c），隨

第二章PBDEQ誘導(dǎo)BV2細(xì)胞發(fā)生自噬19MDC綠色熒光增強，也表明了自噬體形成的增加。圖2-2（d）中，隨著PBDEQ給藥濃度增加，與對照組相比，PBDEQ組細(xì)胞內(nèi)AO紅色熒光強度增強，說明自噬體形成增多。綜上，PBDEQ能夠誘導(dǎo)BV2細(xì)胞自噬活性增強。圖2-2PBDEQ誘導(dǎo)BV2細(xì)胞自噬的發(fā)生。（a）PBDEQ以濃度（0、5、10μM）處理BV2細(xì)胞24h后，WesternBlot實驗檢測LC3B，p62蛋白表達(dá)情況。（b）免疫熒光實驗檢測PBDEQ處理BV2細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)LC3B表達(dá)情況（標(biāo)尺棒為10μm）。（c）MDC染色法檢測PBDEQ暴露后細(xì)胞內(nèi)自噬體形成情況。（d）AO染色法檢測PBDEQ暴露后細(xì)胞內(nèi)自噬體形成情況（標(biāo)尺棒為10μm）。所有數(shù)據(jù)均以三組獨立實驗的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用t檢驗（p＜0.05表示兩組間比較有顯著性差異）。Fig.2-2PBDEQinducedautophagyinBV2cells.(a)TotalproteinswereextractedfromBV2cellsaftertreatingwithPBDEQfor24h,andweresubjectedtoanalysistheLC3Bandp62expressionbywesternblot.(b)ImmunofluorescencestainingforendogenousLC3Bpunctaformation(green)usedtodetectautophagyaftertreatingwithPBDEQ(10μM)for24hinBV2cells.CellnucleiwerecountertainedwithDAPI(blue)(scalebars:10μm).(c)CellswereexposedtoPBDEQfor24hforMDCstaining.Thedatawereobtainedbyflowcytometry.(d)AOstainingdetectedtheformationofautolysosome(red)withexposuretoPBDEQfor24hinBV2cells.Theimageswerecapturedbyfluorescencemicroscopyatthemagnifcationof200×(scalebars:10μm).Alldatawereexpressedasmeans±SDofthreeindependentexperiments.P-valueswerecalculatedbyt-testandcomparedwithcontrolgroup.

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：2990967