目的:通過對三種納米氧化鋅的表征、探討不同粒徑納米氧化鋅對不同分化狀態(tài)人結(jié)腸腺癌細(xì)胞的毒性作用并建立Caco-2細(xì)胞單層模型,闡明納米材料對Caco-2細(xì)胞毒效應(yīng)的關(guān)鍵影響因素及納米氧化鋅跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)特征及其發(fā)生機(jī)制。方法:1.納米氧化鋅表征通過采用透射電鏡和納米粒徑、電位分析儀、X射線衍射對三種不同的納米氧化鋅顆粒進(jìn)行表征,檢測納米氧化鋅顆粒在培養(yǎng)液中的溶解率。2.不同粒徑納米氧化鋅對Caco-2細(xì)胞的毒性作用將Caco-2細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)24 h(未分化細(xì)胞)或21天(分化細(xì)胞),選用三種不同尺寸的納米氧化鋅顆粒,分別為ZnO-20(25.3±5.8 nm)、ZnO-L(25.6±5.7 nm)和ZnO-100(96.7±42.7 nm),設(shè)置不同的劑量(6.25、12.5、25、50和100μg/ml)與未分化或分化的Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)24 h、48 h或72 h后,細(xì)胞活性檢測(CCK-8法檢測),比色法檢測乳酸脫氫酶(LDH)釋放率的改變以及特征性酶,堿性磷酸酶(ALP)活性改變情況。3.Caco-2細(xì)胞模型的建立及評價將Caco-2細(xì)胞濃度調(diào)整為4×10~5/ml,并接種于Transwell板小室側(cè)內(nèi),共培養(yǎng)21d,在不同的培養(yǎng)日期(3、6、9、12、15、18、21d)測定單層細(xì)胞模型的跨膜電阻、Papp值以及模型小室側(cè)及基底側(cè)的堿性磷酸酶(ALP)表達(dá)改變情況,再通過透射電鏡觀察不同階段細(xì)胞分化情況,綜合評價Caco-2單層細(xì)胞模型是否建立成功并發(fā)展后期轉(zhuǎn)運(yùn)試驗。4.納米氧化鋅在Caco-2細(xì)胞模型上的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)及機(jī)制研究將三種納米氧化鋅的濃度設(shè)置為50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml、6.25mg/ml,,每個濃度設(shè)置2個復(fù)孔,分別吸取三種納米化鋅各0.5ml加至Caco-2單層細(xì)胞模型小室側(cè),在不同的孵育時間從基底側(cè)吸取培養(yǎng)液,采用ICP-MS法檢測鋅含量。設(shè)置為對照組、低溫抑制組、阿米洛利組(2.5 mmol/L)、甲基β-環(huán)糊精組,低密度脂蛋白組(100μg/m L)、氯丙嗪組(10μg/m L)。在Caco-2細(xì)胞模型小室內(nèi)加入上述不同的抑制劑,小室側(cè)(BL側(cè))分別加入三種不同的納米氧化鋅6.25ug/ml,0.5ml,在培養(yǎng)不同時間從基底側(cè)取培養(yǎng)液,ICP-MS法檢測鋅含量。結(jié)果:1.三種納米氧化鋅的粒徑大小分別為25.3±5.8nm、96.7±42.7nm和25.6±5.7nm,并呈三種不同的形狀。晶體結(jié)構(gòu)檢測提示三種納米氧化鋅均為六角纖維鋅礦結(jié)構(gòu),且三種納米氧化鋅比表面積均不相同。在不同條件下的培養(yǎng)液中粒徑分布不同,團(tuán)聚狀態(tài)不同,電位不同,納米氧化鋅在培養(yǎng)液中的溶解率為27%。2.在不同濃度條件下,三種納米氧化鋅均可抑制分化或未分化細(xì)胞活性,通過影響細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性造成LDH釋放率升高,并且對堿性磷酸酶(ALP)的表達(dá)量具有抑制作用,上述作用均存在劑量反應(yīng)關(guān)系。在相同濃度條件下,粒徑越小毒性越大,而粒徑相近時,毒性仍有差別可能與顆粒的形狀等其他性質(zhì)有關(guān)。同時,對于同一種納米材料毒性作用,未分化細(xì)胞的敏感性較分化細(xì)胞強(qiáng),對未分化細(xì)胞毒性作用更強(qiáng)。3.建立了Caco-2細(xì)胞模型。以4×10~5/ml的濃度將細(xì)胞接種與Transwell板,培養(yǎng)21d,細(xì)胞分化為小腸上皮細(xì)胞,呈致密連接狀態(tài),透射電鏡觀察可見微絨毛等結(jié)構(gòu),TEER值上升至1000Ω*cm2趨于穩(wěn)定,滲透出物熒光黃在培養(yǎng)21天后透過率下降至16%;腸腔側(cè)(AP側(cè))ALP酶活性高于基底側(cè)(BL側(cè)),活性比值為4.2倍。本實(shí)驗各項指標(biāo)均達(dá)到Caco-2單層細(xì)胞模型建立的標(biāo)準(zhǔn)。4.通過ZnO-20、ZnO-100、ZnO-L三種不同的納米氧化鋅在已建立的Caco-2單層細(xì)胞模型上的轉(zhuǎn)運(yùn)后結(jié)果提示,納米氧化鋅在模型上的轉(zhuǎn)運(yùn)過程為主動轉(zhuǎn)運(yùn)方式,并隨著納米氧化鋅的添加濃度及時間的增加,轉(zhuǎn)運(yùn)量及轉(zhuǎn)運(yùn)率隨之增加。通過添加不同的內(nèi)吞途徑抑制劑,研究納米氧化鋅的內(nèi)吞途徑,發(fā)現(xiàn)納米氧化鋅入胞途徑具有多樣性,并呈現(xiàn)能量依賴性。結(jié)論:1.納米氧化鋅對Caco-2細(xì)胞的毒性作用與其粒徑、形狀等理化性質(zhì)以及細(xì)胞分化狀態(tài)均相關(guān)。2.本實(shí)驗條件下建立的Caco-2單層細(xì)胞模型各項驗證指標(biāo)滿足其完整性、細(xì)胞極性、通透性的要求可用于納米氧化鋅的轉(zhuǎn)運(yùn)試驗。3.納米氧化鋅通過主動轉(zhuǎn)運(yùn)方式轉(zhuǎn)運(yùn),并與濃度及時間成正相關(guān),入胞途徑具有多樣性,并呈現(xiàn)能量依賴性;
【學(xué)位單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R114
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
中英文對照表
第一部分 納米氧化鋅理化性質(zhì)鑒定
    前言
    材料與方法
    結(jié)果與分析
    討論
    本章小結(jié)
第二部分 三種納米氧化鋅對不同分化狀態(tài)Caco-2細(xì)胞的毒性作用研究
    前言
    材料與方法
    結(jié)果與分析
    討論
    本章小結(jié)
第三部分 Caco-2單層細(xì)胞模型建立及評價
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    本章小結(jié)
第四部分 納米氧化鋅在Caco-2細(xì)胞模型上的吸收機(jī)制研究
    前言
    材料與方法
    結(jié)果與分析
    討論
    本章小結(jié)
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述
    綜述參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
個人簡介
開題、中期及學(xué)位論文答辯委員組成

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2860845