發(fā)布時間：2017-04-03 04:06

  本文關鍵詞：光纖倏逝波生物傳感器快速檢測水中沙門菌和腸炎沙門菌的方法研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：沙門菌主要通過污染水和食品引人致病,是世界上最常見的引發(fā)水源性和食源性疾病爆發(fā)的致病菌,具有十分重要的公共衛(wèi)生學意義。沙門菌感染已經成為世界范圍內的公共衛(wèi)生問題,其危害性日益受到人們重視。目前,我國沙門菌檢測依然以傳統(tǒng)的細菌分離方法為主,檢測周期為5-7天,操作繁瑣和耗時長,不利于沙門菌感染爆發(fā)時的預防和控制。光纖生物傳感器能滿足致病菌的快速檢測需要,為沙門菌的快速檢測提供一種新的方法。 研究目的 1.利用光纖生物傳感器具有現(xiàn)場快速檢測的優(yōu)勢,初步建立沙門菌的快速檢測平臺,可為沙門菌和其他常見致病菌的快速檢測提供技術平臺。 2.采用雜交瘤細胞技術,制備腸炎沙門菌單克隆抗體,并對該抗體的特異性、濃度、效價和單抗亞型進行鑒定。 3.利用實驗室制備的腸炎沙門菌單克隆抗體,依托光纖生物傳感器具有快速檢測的優(yōu)勢,建立腸炎沙門菌的快速檢測方法。 研究內容和方法 1.研究光纖生物傳感器快速檢測水中沙門菌的方法,采用生物素標記的多克隆抗體為捕獲抗體,Alexa Fluor647熒光素標記的沙門菌多克隆抗體為檢測抗體,結合親和素-生物素系統(tǒng)的放大效應,采用雙抗體夾心免疫反應模式進行沙門菌檢測。對捕獲抗體濃度和檢測抗體的濃度進行了優(yōu)化實驗,確定了本實驗所用的最佳檢測條件,對方法的靈敏度和特異度進行了評價,同時對環(huán)境水樣進行加標后檢測,驗證方法的靈敏度和特異度。 2.采用小劑量長周期的免疫方案。以甲醛滅活的腸炎沙門菌為免疫原,采用梯度濃度劑量分組免疫12只小鼠,免疫途徑采用小鼠腹腔注射,免疫劑量分別為2.5×108、5×107、1×107、5×106cfu,同時加入佐劑以刺激小鼠的免疫系統(tǒng),觀察小鼠的免疫效果。5次免疫之后,測量小鼠內眥靜脈血,選擇效價高的小鼠進行細胞融合,用間接ELISA方法篩選陽性孔,并對陽性孔進行亞克隆,經過3次亞克隆檢測全陽性之后,最終獲得抗腸炎沙門菌的單克隆細胞株。對獲得的細胞株進行特異度檢測,采用傳統(tǒng)的正辛酸-飽和硫酸銨方法進行純化,之后對其效價、濃度和單抗亞型進行鑒定。 3.研究光纖生物傳感器快速檢測水中腸炎沙門菌的方法,用實驗室制備的單克隆抗體做捕獲抗體,Alexa Fluor647熒光素標記的沙門菌多克隆抗體為檢測抗體,采用雙抗體夾心免疫反應模式進行沙門菌檢測。對捕獲抗體的濃度、檢測抗體的濃度、捕獲抗體與抗原的反應時間、抗原抗體反應體系與檢測抗體的反應時間進行了優(yōu)化,確定實驗所用的最佳檢測條件,同時對方法的靈敏度和特異度進行評價。 研究結果 1.光纖生物傳感器可以在40min內完成水中沙門菌的檢測。該方法檢測沙門菌的靈敏度為5.5×103cfu/mL,與非沙門菌(大腸埃希菌、福氏志賀菌、痢疾志賀菌和金黃色葡萄球菌)無交叉反應現(xiàn)象。對甲型副傷寒沙門菌(A型)、德爾卑沙門菌(B型)、鼠傷寒沙門菌(B型)、豬霍亂沙門菌(C型)、紐波特沙門菌(C型)、腸炎沙門菌(D型)、山夫登堡沙門菌(E型)等7種常見的代表性沙門菌高濃度(107cfu/mL)和低濃度菌液(103cfu/mL、102cfu/mL)進行了檢測,107cfu/mL和103cfu/mL時均能獲得明顯陽性信號值。對無沙門菌的環(huán)境水樣進行了加標檢測,結果顯示,加標后水樣中的沙門菌濃度在4.2×103cfu/mL以上時,樣品檢測結果全為陽性。雙倍TSB增菌實驗表明,水樣沙門菌濃度在50cfu/mL,6h增菌后菌液濃度為3.9×103cfu/mL,能得出陽性信號值,檢測結果為陽性,繼續(xù)增加增菌時間,檢測結果仍為陽性。 2.應用雜交瘤細胞技術制備一株穩(wěn)定分泌腸炎沙門菌單克隆抗體的細胞株,命名為4G11。選擇4G11進行腹水單克隆抗體的擴大生產,采用正辛酸-飽和硫酸銨法純化腹水,抗體效價為1：8000,抗體濃度為1.972mg/mL,抗體亞型為IgG3。 3.采用本實驗室制備的單克隆抗體作為捕獲抗體,利用光纖生物傳感器可以在60min之內完成水中腸炎沙門菌血清型的檢測。探索了捕獲抗體的最優(yōu)稀釋度為1：1000,檢測抗體的最優(yōu)濃度為80μg/mL,捕獲抗體與目標抗原最佳反應時間為10min,抗原抗體反應體系與檢測抗體的最佳反應時間為20min,方法靈敏度為3.0×103cfu/mL。與106cfu/mL的豬霍亂沙門菌、阿貢納沙門菌、紐波特沙門菌、甲型副傷寒沙門菌、德爾卑沙門菌、山夫登堡沙門菌、鴨沙門菌、大腸埃希菌、福氏志賀菌、痢疾志賀菌和金黃色葡萄球菌菌液之間不存在交叉反應。 研究結論 本研究初步建立了光纖生物傳感器快速檢測水中沙門菌的方法,為沙門菌污染嚴重的水樣提供了一種快速檢測的方法,同時為其他常見的致病菌的檢測提供一個技術方法平臺。利用實驗室制備的腸炎沙門菌單克隆抗體建立了光纖生物傳感器快速檢測腸炎沙門菌的方法,為沙門菌流行優(yōu)勢血清型的檢測提供了新的方法。
【關鍵詞】：沙門菌 光纖生物傳感器 快速檢測 單克隆抗體
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R123.1
【目錄】：

• 縮略語表5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 第一章 緒論12-23
• 1 沙門菌及其檢測研究進展12-17
• 2 生物傳感器研究進展17-22
• 3 本課題的研究意義22-23
• 第二章 光纖倏逝波生物傳感器快速檢測水中沙門菌的方法研究23-38
• 1 材料與儀器23-26
• 2 實驗方法26-30
• 3 結果與分析30-36
• 4 討論36-37
• 5 小結37-38
• 第三章 腸炎沙門菌單克隆抗體的制備38-51
• 1. 材料與儀器38-40
• 2 實驗方法40-45
• 3 結果45-47
• 4 討論47-50
• 5 小結50-51
• 第四章 光纖倏逝波生物傳感器快速檢測腸炎沙門菌的方法研究51-60
• 1 材料與儀器51-53
• 2 實驗方法53-56
• 3 結果56-60
• 4 小結60
• 研究結論60-61
• 參考文獻61-67
• 綜述 生物傳感器在食源性致病菌快速檢測方面的應用進展67-81
• 參考文獻76-81
• 致謝81-82
• 個人簡歷82
• 發(fā)表論文情況82

【參考文獻】

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本文編號：283672