【摘要】：目的微囊藻毒素-LR(Microcystin-leucine arginine,MC-LR)是由藍(lán)藻釋放的環(huán)狀七肽細(xì)胞內(nèi)毒素,具有強(qiáng)烈的生殖毒性。然而,人們對(duì)它誘導(dǎo)的雌性生殖系統(tǒng)毒性知之甚少,同時(shí)氧化應(yīng)激在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬中起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。然而,之前沒有研究ROS介導(dǎo)的MC-LR誘導(dǎo)下通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬結(jié)合起來(lái)的生殖毒性。因此,本研究旨在探討MC-LR或MC-LR與N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-acetyl-l-cysteine,NAC)聯(lián)合作用后體內(nèi)外的氧化應(yīng)激水平及抗氧化能力。此外,將探索氧化應(yīng)激對(duì)MC-LR誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERs)和自噬的調(diào)控作用,并揭示NAC對(duì)MC-LR誘導(dǎo)的生殖毒性的保護(hù)作用及分子機(jī)制。方法不同濃度MC-LR(0、1、5、10、20、40、60μg/mL)或不同濃度NAC(0、1、5、10、15、20、40、60 mmol/L)培養(yǎng)KK-1細(xì)胞24 h,通過CCK-8試劑盒聯(lián)合酶標(biāo)儀進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè),確定MC-LR的半數(shù)抑制濃度(inhibitory concentration 50,IC_(50))和NAC的后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。MC-LR(0、8.5、17、34μg/mL)及MC-LR與NAC聯(lián)合作用(34μg/mL MC-LR+10 mmol/L NAC)KK-1細(xì)胞24 h后,分別檢測(cè)KK-1細(xì)胞中ROS含量、SOD活性、細(xì)胞凋亡率及GSH/GSSG;Western Blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中MC-LR的蓄積、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及自噬相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。MC-LR(0、12.5、25、40μg/kg·BW)及MC-LR與NAC聯(lián)合(40μg/kg·BW MC-LR+200 mg/kg·BW NAC)染毒C57BL/6小鼠14天后,檢測(cè)卵巢組織中ROS含量、SOD活性、MDA的含量及GSH/GSSG;HE染色觀察小鼠卵巢組織病理變化;透射電子顯微鏡觀察小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu);TUNEL染色觀察小鼠卵巢組織顆粒細(xì)胞凋亡率;Western Blotting檢測(cè)小鼠卵巢組織中MC-LR的蓄積、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及自噬相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果不同濃度MC-LR染毒KK-1細(xì)胞24 h后,計(jì)算出MC-LR的IC_(50)為34μg/mL;當(dāng)KK-1細(xì)胞暴露不同濃度NAC時(shí),濃度為10 mmol/L時(shí)細(xì)胞活性最好,因此選取濃度10 mmol/L為NAC后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度;Western Blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)不同濃度MC-LR均可以進(jìn)入KK-1細(xì)胞和C57BL/6小鼠卵巢組織中,并且隨著染毒濃度的增大,MC-LR的蛋白條帶逐漸加深。MC-LR可以引起KK-1細(xì)胞內(nèi)ROS大量產(chǎn)生,同時(shí)降低KK-1細(xì)胞的抗氧化能力(SOD活性及GSH/GSSG下降),而抗氧化劑NAC可以緩解MC-LR引起的氧化應(yīng)激和增強(qiáng)抗氧化能力;MC-LR也可以引起C57BL/6小鼠卵巢組織氧化應(yīng)激的發(fā)生(ROS和MDA含量增加),同時(shí)降低SOD活性及GSH/GSSG的比率,而NAC的預(yù)處理可以抵抗MC-LR引起的氧化應(yīng)激,同時(shí)可以增強(qiáng)GSH/GSSG比率。盡管在NAC預(yù)處理后SOD活性略微上調(diào),但與MC-LR(40μg/kg·BW)組相比沒有顯著差異。MC-LR可以誘導(dǎo)C57BL/6小鼠卵巢組織及超微結(jié)構(gòu)發(fā)生病理?yè)p傷,而預(yù)先加入氧化應(yīng)激抑制劑NAC后可以緩解MC-LR誘導(dǎo)的小鼠卵巢組織及超微結(jié)構(gòu)的病理?yè)p傷。MC-LR可以增加KK-1細(xì)胞和C57BL/6小鼠卵巢組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)。預(yù)先NAC干預(yù)后,在KK-1細(xì)胞中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)通路蛋白CHOP、XBP1、P-EIF2α、GRP78和P-PERK表達(dá)與單獨(dú)染毒組(34μg/mL)相比顯著下降(P0.05),自噬相關(guān)蛋白Beclin1、ATG12、ATG5-ATG12、ATG16及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達(dá)與單獨(dú)染毒組(34μg/mL)相比也顯著下降(P0.05);在小鼠卵巢組織中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)通路蛋白表達(dá)與40μg/kg·BW劑量組相比顯著下降(P0.05),自噬相關(guān)蛋白Beclin1、ATG5-ATG12、ATG16表達(dá)與40μg/kg·BW劑量組相比顯著下降(P0.05)。MC-LR同時(shí)可以引起小鼠卵巢組織顆粒細(xì)胞凋亡率增加,而抑制氧化應(yīng)激可以抵抗MC-LR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。結(jié)論1.MC-LR可以引起KK-1細(xì)胞和C57BL/6小鼠卵巢氧化應(yīng)激2.氧化應(yīng)激調(diào)控MC-LR誘導(dǎo)的KK-1細(xì)胞和C57BL/6小鼠卵巢內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及自噬。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R114
【圖文】：

圖 3.1 MC-LR 及 NAC 對(duì) KK-1 細(xì)胞活性的影響注：A 代表 MC-LR 對(duì) KK-1 細(xì)胞活性的影響；B 代表 NAC 對(duì) KK-1 細(xì)胞活性的影響。*代表與對(duì)照組相比，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.2 不同濃度 MC-LR 可以進(jìn)入 KK-1 細(xì)胞和 C57BL/6 小鼠卵巢組織KK-1 細(xì)胞或 C57BL/6 小鼠暴露不同濃度的 MC-LR，然后使用 WesternBloting 檢測(cè) KK-1 細(xì)胞或者卵巢組織中是否有 MC-LR 存在。如圖 3.2 所示，在單獨(dú) NAC 組和對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn) MC-LR 條帶（體外：0 μg/mL，體內(nèi)：0 μg/kg BW）。但低劑量組（體外：8.5 μg/mL，體內(nèi)：12.5 μg/kg BW）、中劑量組（體外：17 μg/mL，體內(nèi)：25 μg/kg BW）、高劑量組（體外： 34 μg/mL，體內(nèi)：40 μg/kg BW）和NAC+MC-LR 組均發(fā)現(xiàn) MC-LR 帶，并且隨著染毒濃度的增大，條帶變得越來(lái)越深，這表明 MC-LR 可以進(jìn)入 KK -1 細(xì)胞或卵巢組織中。

圖 3.1 MC-LR 及 NAC 對(duì) KK-1 細(xì)胞活性的影響注：A 代表 MC-LR 對(duì) KK-1 細(xì)胞活性的影響；B 代表 NAC 對(duì) KK-1 細(xì)胞活性的影響。*代表與對(duì)照組相比，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.2 不同濃度 MC-LR 可以進(jìn)入 KK-1 細(xì)胞和 C57BL/6 小鼠卵巢組織KK-1 細(xì)胞或 C57BL/6 小鼠暴露不同濃度的 MC-LR，然后使用 WesternBloting 檢測(cè) KK-1 細(xì)胞或者卵巢組織中是否有 MC-LR 存在。如圖 3.2 所示，在單獨(dú) NAC 組和對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn) MC-LR 條帶（體外：0 μg/mL，體內(nèi)：0 μg/kg BW）。但低劑量組（體外：8.5 μg/mL，體內(nèi)：12.5 μg/kg BW）、中劑量組（體外：17 μg/mL，體內(nèi)：25 μg/kg BW）、高劑量組（體外： 34 μg/mL，體內(nèi)：40 μg/kg BW）和NAC+MC-LR 組均發(fā)現(xiàn) MC-LR 帶，并且隨著染毒濃度的增大，條帶變得越來(lái)越深，這表明 MC-LR 可以進(jìn)入 KK -1 細(xì)胞或卵巢組織中。

圖 3.3 不同濃度 MC-LR 對(duì) KK-1 細(xì)胞 ROS 的影響及 NAC 的抑制作用注： 流式細(xì)胞儀檢測(cè)。A：對(duì)照組； B：8.5 μg/mL；C：17 μg/mL；D：34 μg/mL；E：34 μg/mL + NAC；F：NAC；G：KK-1 細(xì)胞中 ROS 平均熒光強(qiáng)度的定量分析。*代表與對(duì)照組相比，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，#代表與單獨(dú) 34 μg/mL 劑量組相比，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 馬紅霞;羅建江;;吸煙與非吸煙慢性阻塞性肺疾病患者炎癥氧化應(yīng)激和肺功能的對(duì)比分析[J];山西醫(yī)藥雜志;2016年16期

2 郭瑞萍;李建強(qiáng);馮博琳;劉曉紅;;血清γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶水平與肺功能及慢性阻塞性肺疾病的關(guān)系[J];中國(guó)藥物與臨床;2015年06期

3 范志紅;;冬季霧霾多,如何健康飲食[J];中國(guó)老年;2016年01期

4 田一明;陳偉;王喜太;;氫治療疾病的原理及其應(yīng)用進(jìn)展[J];現(xiàn)代養(yǎng)生;2017年10期

5 張穎;韓威;胡林森;;氧化應(yīng)激在帕金森病發(fā)病機(jī)制中的作用[J];廣東醫(yī)學(xué);2006年04期

6 喬華,王廣發(fā),丁翠敏;氧化應(yīng)激與睡眠呼吸暫停綜合征[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).呼吸系統(tǒng)分冊(cè);2005年08期

7 劉凌云,曾勉;氧化應(yīng)激與慢性阻塞性肺疾病[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).呼吸系統(tǒng)分冊(cè);2005年10期

8 唐曦p\;;神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J];科技展望;2016年35期

9 李洪亮;張秋芳;鄭雪皎;喬靜;汪選斌;;中藥抗肝氧化應(yīng)激的研究進(jìn)展[J];醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);2013年12期

10 潘麗鳳;黃美杏;;氧化應(yīng)激對(duì)慢性阻塞性肺疾病的影響[J];現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué);2010年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 田志巖;張惠紅;李攀;周玉穎;鄒永明;王艷;張淼;;探究輕度認(rèn)知功能障礙患者氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的特點(diǎn)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十八次全國(guó)神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編（上）[C];2015年

2 黃園;陳志慶;邱卓君;丘衛(wèi);林燕;;運(yùn)動(dòng)對(duì)血液氧化應(yīng)激態(tài)的影響[A];2002年第9屆全國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2002年

3 田小軍;;甲狀腺癌氧化應(yīng)激指數(shù)的變化[A];紀(jì)念中國(guó)微生物學(xué)會(huì)臨床微生物學(xué)專業(yè)委員會(huì)成立五周年-第五屆中國(guó)臨床微生物學(xué)大會(huì)暨臺(tái)灣海峽兩岸微生物學(xué)與免疫學(xué)論壇論文匯編[C];2014年

4 劉佳;宋治;陳茹;楊衡;鄭文;劉鼎;張忱;鄧昊;胡中揚(yáng);;大動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死發(fā)病與氧化應(yīng)激通路上多個(gè)基因多態(tài)性相關(guān)性研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十七次全國(guó)神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編（下）[C];2014年

5 田陽(yáng);;氧化應(yīng)激過程電化學(xué)分析的新進(jìn)展[A];第十三屆全國(guó)電分析化學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議會(huì)議論文摘要集[C];2017年

6 王莉;姚華;馬玲;;尿酸與氧化應(yīng)激關(guān)系的研究進(jìn)展[A];老年?duì)I養(yǎng)研究進(jìn)展與老年?duì)I養(yǎng)供餐規(guī)范研討會(huì)暨糖尿病腎病醫(yī)學(xué)營(yíng)養(yǎng)治療進(jìn)展學(xué)習(xí)班資料匯編[C];2011年

7 馮馬龍;徐堅(jiān);艾紅軍;;氧化應(yīng)激條件下金屬鈮對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞毒性作用研究[A];第十二次全國(guó)口腔修復(fù)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2018年

8 張曉啟;劉爽;王振國(guó);;燒傷后氧化應(yīng)激與抗氧化劑治療[A];全國(guó)危重?zé)齻颊咴缙趶?fù)蘇對(duì)策專題研討會(huì)論文匯編[C];2005年

9 閻婷婷;徐光翠;彭強(qiáng);吳衛(wèi)東;易憲文;趙英政;;氧化應(yīng)激與炎癥在糖尿病模型小鼠腎臟損傷中的作用[A];2018環(huán)境與健康學(xué)術(shù)會(huì)議--精準(zhǔn)環(huán)境健康：跨學(xué)科合作的挑戰(zhàn)論文匯編[C];2018年

10 劉釗;邊云飛;肖傳實(shí);楊慧宇;;晚期糖基化終產(chǎn)物通過氧化應(yīng)激引起人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡[A];第十三次全國(guó)心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2011年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 任靜;黑豆可為血管“減齡”[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2017年

2 王南方;葉紅平 從普通一兵到藥業(yè)新銳[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2009年

3 記者 盧蘇燕;多食單糖有害健康[N];新華每日電訊;2003年

4 熊昌彪;氧化應(yīng)激研究與中醫(yī)治未病“不謀而合”[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2008年

5 ;遠(yuǎn)離疾病,科學(xué)家找到新方法[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2009年

6 ;預(yù)防疾病,進(jìn)入“氧化應(yīng)激”時(shí)代[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2009年

7 靈諾;身體異常與“氧化應(yīng)激”有關(guān)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2009年

8 記者 項(xiàng)錚;氧化應(yīng)激干擾有望成為預(yù)防疾病新手段[N];科技日?qǐng)?bào);2008年

9 朱作霖;氧化應(yīng)激干擾有望成為預(yù)防疾病新手段[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2007年

10 褚曉明;老年癡呆與氧化應(yīng)激有關(guān)聯(lián)[N];健康報(bào);2004年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 孟凡會(huì);中藥更年春方抗衰老及其作用機(jī)制的研究[D];吉林大學(xué);2018年

2 卓乃強(qiáng);白藜蘆醇對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)下髓核細(xì)胞的作用及其機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2018年

3 張乃今;去乙酰化酶SIRT2及Septin4在心臟血管損傷疾病的作用及其機(jī)制研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2018年

4 王若曦;OGG1在氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞死亡中的作用及機(jī)制研究[D];東北師范大學(xué);2018年

5 黃宏;活性氧的分析新方法及其分子機(jī)制研究[D];華東師范大學(xué);2018年

6 張乃s

本文編號(hào)：2781734