【摘要】：目的丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)廣泛應(yīng)用于各工業(yè)生產(chǎn)活動中,職業(yè)人群長期暴露于ACR可發(fā)生感覺-運(yùn)動型周圍神經(jīng)病。相關(guān)研究表明:ACR中毒可致神經(jīng)組織內(nèi)神經(jīng)絲(Neurofilaments,NFs)異常磷酸化。鈣蛋白水解酶(Calpain)依賴Ca2+激活,可改變蛋白激酶活性。蛋白激酶可磷酸化修飾NFs,從而影響其組裝、解聚及轉(zhuǎn)運(yùn)。因此,我們推測ACR所致的神經(jīng)絲異常磷酸化與calpain介導(dǎo)的蛋白激酶改變相關(guān),建立神經(jīng)干細(xì)胞(Neural Stem Cells,NSCs)ACR中毒及鈣蛋白酶抑制劑Calpeptin(CP)干預(yù)模型,測定細(xì)胞內(nèi)NFs的磷酸化水平,calpain、蛋白激酶A(Protein Kinase A,PKA)、蛋白激酶 C(ProteinKinase C,PKC)及周期素依賴性蛋白激酶5(Cyclin-dependent kinase 5,Cdk5)含量,以探討ACR致NFs異常磷酸化的機(jī)制及CP對其的干預(yù)作用,為預(yù)防和治療ACR中毒提供理論依據(jù)。方法1 NSCs的原代培養(yǎng)與鑒定無菌條件下,取新生Wistar乳鼠(24h內(nèi))的脊髓背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal Root Ganglion,DRG)進(jìn)行原代培養(yǎng)。NSCs鑒定:免疫熒光法檢測NSCs特異性表達(dá)巢蛋白(Nestin)、神經(jīng)元特異性表達(dá)烯醇化酶(Neuron Specific Enolase,NSE)及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性表達(dá)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)。2實驗?zāi)Ｐ偷慕⒃?xì)胞培養(yǎng)至第4天,細(xì)胞處于生長對數(shù)期,將其分為4組:空白對照組(僅完全培養(yǎng)基)、CP對照組(4μmol/LCP)、ACR染毒組(760μmol/LACR)、經(jīng)CP干預(yù)的ACR染毒組(760μmol/L ACR及4μmol/L CP)。處理時間為48h。3免疫熒光法測定NFs磷酸化水平,并觀察其胞內(nèi)分布。4 Western blot 法分析 NSCs 中磷酸化的神經(jīng)絲(p-NF-H)、μ-calpain、m-calpain、PKA、PKC及Cdk5的含量。5應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,組間兩兩比較用Dunnett-t檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1 NSCs的原代培養(yǎng)與鑒定NSCs原代細(xì)胞24h內(nèi)貼壁,第3d開始進(jìn)入快速生長期,生長旺盛,6～7d可長滿100cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿底部。免疫熒光染色顯示,90%以上原代培養(yǎng)的NSCs呈Nestin陽性。相同來源的細(xì)胞經(jīng)1μmol/L的維生素A誘導(dǎo)分化,可呈NSE陽性及GFAP陽性。2 NFs磷酸化水平改變2.1免疫熒光定性分析與空白對照組組比,CP組無明顯改變;ACR組熒光強(qiáng)度增加,除胞體與核周分布外,軸突中亦分布;ACR+CP組熒光強(qiáng)度相近,胞體與核周皆有分布,軸突中亦有少量分布。與ACR模型組比,ACR+CP組熒光強(qiáng)度稍有降低,軸突中分布減少。2.2 p-NF-H含量改變與空白對照組比,CP組無明顯改變;ACR組p-NF-H含量上升67.3%(P0.05);ACR+CP 組p-NF-H含量上升 32.3%(P0.05)。與 ACR模型組比,ACR+CP組 p-NF-H 含量下降 35%(P0.05)。3 calpain含量改變3.1 μ-calpain 含量改變與空白對照組組比,CP組無明顯改變;ACR組μ-calpain含量上升56.1%(P0.05);ACR+CP 組 μ-calpain 含量降低 3.3%(P0.05)。與 ACR 組相比,ACR+CP組的μ-calpain 含量降低 59.4%(P0.05)。3.2 m-calpain含量改變與空白對照組組比,CP組無明顯改變;ACR組m-calpain含量上升121.7%(P0.05);ACR+CP 組 m-calpain 含量升高 74.1%(P0.05)。與 ACR 組相比,ACR+CP 組 m-calpain 含量降低 47.6%(P0.05)。4蛋白激酶含量改變4.1 PKC含量改變與空白對照組組比,CP組無明顯改變;ACR組PKC含量下降23.6%(P0.05),ACR+CP 組 PKC 含量降低 0.9%(P0.05);與 ACR 組相比,ACR+CP 組 PKC含量上升22.7%(P0.05)。4.2 PKA含量改變與空白對照組組比,CP組無明顯改變;ACR組PKA含量下降23.0%(P0.05),ACR+CP組PKA含量升高(P0.05);與ACR組相比,ACR+CP組PKA含量上升 29.8%(P0.05)。4.3 Cdk5含量改變與空白對照組組比,CP組無明顯改變;ACR組Cdk5含量上升64.6%(P0.05);ACR+CP 組 Cdk5 含量升高 49.4%(P0.05);與 ACR 組相比,ACR+CP 組 Cdk5含量下降 15.2%(P0.05)。結(jié)論1.成功建立了神經(jīng)干細(xì)胞ACR中毒及CP干預(yù)模型。2.ACR可致神經(jīng)干細(xì)胞NFs磷酸化水平異常,CP能夠干預(yù)這種改變。3.ACR所致NFs異常磷酸化可能與calpain介導(dǎo)的PKA、PKC改變相關(guān),CP通過干預(yù)calpain、PKA及PKC改變拮抗ACR中毒。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2737193