【摘要】：目的采用同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技術(shù)篩選與轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β1活化成纖維細(xì)胞有關(guān)的差異蛋白,以期為研究矽肺纖維化的發(fā)病機(jī)制、防治策略提供新思路。方法貼壁法體外原代培養(yǎng)Wistar大鼠肺成纖維細(xì)胞,采用TGF-β1(5 ng/ml)誘導(dǎo)其活化,分為對照組、TGF-β1誘導(dǎo)組。采用iTRAQ技術(shù)標(biāo)記蛋白樣品,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)對標(biāo)記的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析,篩選對照組與TGF-β1誘導(dǎo)組中差異表達(dá)的蛋白。通過HOPE-MED8050動式染塵控制系統(tǒng)構(gòu)建矽肺大鼠模型,分為對照24周組(control 24 w)、矽肺模型24周組(silicosis 24 w)。體外培養(yǎng)來源于對照24周組和矽肺模型24周組大鼠肺成纖維細(xì)胞。構(gòu)建針對極低密度脂蛋白受體(Very low-density lipoprotein receptor,VLDLR)、多配體蛋白聚糖2(Syndecan-2,SDC2)的基因沉默載體并轉(zhuǎn)染入人胚肺成纖維(MRC-5)細(xì)胞中,篩選有效沉默序列后分為:陰性對照組(Negative Control,NC)、VLDLR基因沉默組(VLDLRsiRNA#3)、SDC2基因沉默組(SDC2siRNA#3)、陰性對照+TGF-1誘導(dǎo)組(NC+TGF-β1)、VLDLR基因沉默+TGF-β1誘導(dǎo)組(VLDLRsiRNA#3+TGF-β1)、SDC2基因沉默+TGF-β1誘導(dǎo)組(SDC2siRNA#3+TGF-β1)。VG染色觀察肺組織病理形態(tài)。免疫組織化學(xué)染色法檢測V型膠原[Collagen alpha-1(V)chain,pro COL V]、XI型膠原[Collagen alpha-1(XI)chain,pro COL XI]、VLDLR、SDC2的表達(dá)與定位。免疫印跡法檢測I型膠原(Collagen Type I,pro COL I)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、pro COL V、pro COL XI、血管細(xì)胞粘附因子1(Vascular cell adhesion protein 1,VCAM1)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白214(Transmembrane protein 214,TM214)、VLDLR、SDC2的表達(dá)。結(jié)果1 iTRAQ技術(shù)共鑒定出1648個蛋白。與對照組相比較,TGF-β1誘導(dǎo)組有196個差異蛋白表達(dá)變化≥1.20倍,其中20個差異蛋白表達(dá)變化≥1.50倍(13個上調(diào)蛋白,7個下調(diào)蛋白)。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示差異蛋白主要與細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥反應(yīng),以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等多方面功能有關(guān)。2 VG染色結(jié)果顯示,對照24周組肺組織肺泡壁薄,結(jié)構(gòu)清晰完整,且無膠原沉積,模型24周組肺組織可見肺泡壁明顯增寬,并有較多的細(xì)胞性和纖維性矽結(jié)節(jié)形成以及紅色膠原沉積。3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,與對照24周組相比較,矽肺模型24周組pro COL V、pro COL XI、VLDLR、SDC2陽性表達(dá)明顯增強(qiáng),多表達(dá)于矽結(jié)節(jié)以及間質(zhì)纖維化區(qū)域。4 Western blot結(jié)果顯示,矽肺模型24周組肺組織pro COL I、α-SMA、pro COL V、pro COL XI、VCAM1、VLDLR和SDC2表達(dá)上調(diào),分別為對照24周組11.09倍、27.17倍、7.03倍、3.61倍、12.16倍、2.39倍和21.12倍,而TM214無差異表達(dá)變化。在原代培養(yǎng)模型組24周矽肺大鼠成纖維細(xì)胞中pro COL I、α-SMA、pro COL V、pro COL XI、VCAM1、VLDLR和SDC2表達(dá)明顯上調(diào),分別為對照24周組6.16倍、5.63倍、29.34倍、13.74倍、4.09倍、80.58倍和4.06倍,而TM214無差異表達(dá)變化。5細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗:(1)Western blot結(jié)果可見,轉(zhuǎn)染VLDLR、SDC2沉默質(zhì)粒序列于MRC-5細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),與NC組相比較,VLDLRsiRNA#3有明顯沉默效果,VLDLR的表達(dá)降至NC組6.65%;同樣,與NC組相比較,SDC2siRNA#3有明顯沉默效果,SDC2的表達(dá)降至NC組21.14%。(2)Western blot結(jié)果顯示,VLDLRsiRNA#3組pro COL I、α-SMA、pro COL V、pro COL XI表達(dá)下調(diào),分別降至NC組32.57%、42.55%、60.85%和16.65%;同樣,SDC2siRNA#3組pro COL I、pro COL V、pro COL XI表達(dá)下調(diào),分別降至NC組5.43%、19.41%和8.13%,而α-SMA無差異表達(dá)變化。(3)Western blot結(jié)果顯示,在VLDLR轉(zhuǎn)染實驗中,與NC組相比較,NC+TGF-β1誘導(dǎo)組pro COL I、α-SMA、pro COL V、pro COL XI表達(dá)上調(diào),分別為NC組3.78倍、3.71倍、12.38倍和10.78倍,VLDLRsiRNA#3+TGF-β1誘導(dǎo)組pro COL I、α-SMA、pro COL V、pro COL XI的表達(dá)明顯下調(diào),分別降至NC+TGF-β1誘導(dǎo)組的73.66%、55.70%、22.47%和50.06%;同樣在SDC2轉(zhuǎn)染實驗中,NC+TGF-β1誘導(dǎo)組pro COL I、α-SMA、pro COL V、pro COL XI表達(dá)較NC組明顯上調(diào),SDC2siRNA#3+TGF-β1誘導(dǎo)組pro COL I、pro COL V、pro COL XI表達(dá)明顯下調(diào),分別降至NC+TGF-β1誘導(dǎo)組的44.95%、32.04%和37.63%,而α-SMA無差異表達(dá)變化。結(jié)論1 iTRAQ技術(shù)篩選出了196個與TGF-β1介導(dǎo)成纖維細(xì)胞活化有關(guān)的差異蛋白,其中pro COL V、pro COL XI、VCAM1、VLDLR和SDC2可能參與了矽肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展。2基因沉默VLDLR、SDC2可在基礎(chǔ)水平和TGF-β1誘導(dǎo)條件下抑制MRC-5細(xì)胞中膠原的合成。圖14幅;表20個;參141篇。
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R135.2
【圖文】：

注：A：對照 24 周組（×12.5）；B：矽肺 24 周組（×12.5）；C：對照 24 周組（×400）；D：矽肺 24 周組（×400）圖 1 矽肺大鼠肺組織的病理學(xué)改變（VG 染色）

華北理工大學(xué)碩士學(xué)位論文rn blot 結(jié)果顯示（圖 2、表 10）：pro COL I、α表達(dá)明顯上調(diào)，分別為對照組 11.09 倍、27.17 倍在原代培養(yǎng)矽肺模型 24 周組大鼠的肺成纖維細(xì)顯上調(diào)，與體內(nèi)結(jié)果一致，分別為對照 24 周組具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。proControl Silicosis

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2736492