【摘要】：目的采用同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技術篩選與轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β1活化成纖維細胞有關的差異蛋白,以期為研究矽肺纖維化的發(fā)病機制、防治策略提供新思路。方法貼壁法體外原代培養(yǎng)Wistar大鼠肺成纖維細胞,采用TGF-β1(5 ng/ml)誘導其活化,分為對照組、TGF-β1誘導組。采用iTRAQ技術標記蛋白樣品,液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)對標記的蛋白進行質譜分析,篩選對照組與TGF-β1誘導組中差異表達的蛋白。通過HOPE-MED8050動式染塵控制系統(tǒng)構建矽肺大鼠模型,分為對照24周組(control 24 w)、矽肺模型24周組(silicosis 24 w)。體外培養(yǎng)來源于對照24周組和矽肺模型24周組大鼠肺成纖維細胞。構建針對極低密度脂蛋白受體(Very low-density lipoprotein receptor,VLDLR)、多配體蛋白聚糖2(Syndecan-2,SDC2)的基因沉默載體并轉染入人胚肺成纖維(MRC-5)細胞中,篩選有效沉默序列后分為:陰性對照組(Negative Control,NC)、VLDLR基因沉默組(VLDLRsiRNA#3)、SDC2基因沉默組(SDC2siRNA#3)、陰性對照+TGF-1誘導組(NC+TGF-β1)、VLDLR基因沉默+TGF-β1誘導組(VLDLRsiRNA#3+TGF-β1)、SDC2基因沉默+TGF-β1誘導組(SDC2siRNA#3+TGF-β1)。VG染色觀察肺組織病理形態(tài)。免疫組織化學染色法檢測V型膠原[Collagen alpha-1(V)chain,pro COL V]、XI型膠原[Collagen alpha-1(XI)chain,pro COL XI]、VLDLR、SDC2的表達與定位。免疫印跡法檢測I型膠原(Collagen Type I,pro COL I)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、pro COL V、pro COL XI、血管細胞粘附因子1(Vascular cell adhesion protein 1,VCAM1)、內質網跨膜蛋白214(Transmembrane protein 214,TM214)、VLDLR、SDC2的表達。結果1 iTRAQ技術共鑒定出1648個蛋白。與對照組相比較,TGF-β1誘導組有196個差異蛋白表達變化≥1.20倍,其中20個差異蛋白表達變化≥1.50倍(13個上調蛋白,7個下調蛋白)。生物信息學分析結果顯示差異蛋白主要與細胞增殖、凋亡、炎癥反應,以及信號轉導通路等多方面功能有關。2 VG染色結果顯示,對照24周組肺組織肺泡壁薄,結構清晰完整,且無膠原沉積,模型24周組肺組織可見肺泡壁明顯增寬,并有較多的細胞性和纖維性矽結節(jié)形成以及紅色膠原沉積。3免疫組織化學染色結果顯示,與對照24周組相比較,矽肺模型24周組pro COL V、pro COL XI、VLDLR、SDC2陽性表達明顯增強,多表達于矽結節(jié)以及間質纖維化區(qū)域。4 Western blot結果顯示,矽肺模型24周組肺組織pro COL I、α-SMA、pro COL V、pro COL XI、VCAM1、VLDLR和SDC2表達上調,分別為對照24周組11.09倍、27.17倍、7.03倍、3.61倍、12.16倍、2.39倍和21.12倍,而TM214無差異表達變化。在原代培養(yǎng)模型組24周矽肺大鼠成纖維細胞中pro COL I、α-SMA、pro COL V、pro COL XI、VCAM1、VLDLR和SDC2表達明顯上調,分別為對照24周組6.16倍、5.63倍、29.34倍、13.74倍、4.09倍、80.58倍和4.06倍,而TM214無差異表達變化。5細胞轉染實驗:(1)Western blot結果可見,轉染VLDLR、SDC2沉默質粒序列于MRC-5細胞中發(fā)現,與NC組相比較,VLDLRsiRNA#3有明顯沉默效果,VLDLR的表達降至NC組6.65%;同樣,與NC組相比較,SDC2siRNA#3有明顯沉默效果,SDC2的表達降至NC組21.14%。(2)Western blot結果顯示,VLDLRsiRNA#3組pro COL I、α-SMA、pro COL V、pro COL XI表達下調,分別降至NC組32.57%、42.55%、60.85%和16.65%;同樣,SDC2siRNA#3組pro COL I、pro COL V、pro COL XI表達下調,分別降至NC組5.43%、19.41%和8.13%,而α-SMA無差異表達變化。(3)Western blot結果顯示,在VLDLR轉染實驗中,與NC組相比較,NC+TGF-β1誘導組pro COL I、α-SMA、pro COL V、pro COL XI表達上調,分別為NC組3.78倍、3.71倍、12.38倍和10.78倍,VLDLRsiRNA#3+TGF-β1誘導組pro COL I、α-SMA、pro COL V、pro COL XI的表達明顯下調,分別降至NC+TGF-β1誘導組的73.66%、55.70%、22.47%和50.06%;同樣在SDC2轉染實驗中,NC+TGF-β1誘導組pro COL I、α-SMA、pro COL V、pro COL XI表達較NC組明顯上調,SDC2siRNA#3+TGF-β1誘導組pro COL I、pro COL V、pro COL XI表達明顯下調,分別降至NC+TGF-β1誘導組的44.95%、32.04%和37.63%,而α-SMA無差異表達變化。結論1 iTRAQ技術篩選出了196個與TGF-β1介導成纖維細胞活化有關的差異蛋白,其中pro COL V、pro COL XI、VCAM1、VLDLR和SDC2可能參與了矽肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展。2基因沉默VLDLR、SDC2可在基礎水平和TGF-β1誘導條件下抑制MRC-5細胞中膠原的合成。圖14幅;表20個;參141篇。
【學位授予單位】：華北理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R135.2
【圖文】：

注：A：對照 24 周組（×12.5）；B：矽肺 24 周組（×12.5）；C：對照 24 周組（×400）；D：矽肺 24 周組（×400）圖 1 矽肺大鼠肺組織的病理學改變（VG 染色）

華北理工大學碩士學位論文rn blot 結果顯示（圖 2、表 10）：pro COL I、α表達明顯上調，分別為對照組 11.09 倍、27.17 倍在原代培養(yǎng)矽肺模型 24 周組大鼠的肺成纖維細顯上調，與體內結果一致，分別為對照 24 周組具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。proControl Silicosis

【參考文獻】

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本文編號：2736492