發(fā)布時間：2020-06-20 02:30

【摘要】：研究目的:本研究旨在探索采用基于CBG2.8D細(xì)胞株的生物檢測法檢測少量血清內(nèi)二惡英類化合物含量時的前處理方法,并完成對血清樣本的檢測以初步了解其適用性;驗證不同水平二惡英類化合物暴露人群血清中差異顯著的三種載脂蛋白表達量,并對暴露水平和蛋白表達量的關(guān)系進行討論。研究內(nèi)容與方法:1.采用不同濃度TCDD急性暴露的大鼠血清進行前處理方式的探索,進行多次實驗以建立穩(wěn)定有效的適合血清樣本檢測的生物學(xué)檢測(CBG2.8D)方法。找到合適的檢測流程方案后,選取天津市氯化工行業(yè)工人(共7組)的血清樣本作為實驗對象,利用CBG2.8D生物檢測法進行檢測分析,并將結(jié)果與已獲得的高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜儀(HRGC-HRMS)的分析結(jié)果進行對比。2.用Western Blot技術(shù)對蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)中篩選出的差異顯著的三種載脂蛋白ApoCI、ApoCIII、ApoCIV進行驗證并對表達量變化趨勢進行討論。研究結(jié)果:1.實驗發(fā)現(xiàn)對于0.5mL的高二惡英濃度大鼠血清,采用正己烷和異丙醇的有機溶劑萃取法搭配酸性硅膠柱過柱的凈化濃縮的方式進行前處理并采用CBG2.8D生物檢測較為合適,人類血清樣本的生物檢測檢測結(jié)果與高分辨結(jié)果差異較大。2.ApoCI、ApoCIII、ApoCIV的Western Blot的驗證結(jié)果與血清蛋白組學(xué)研究結(jié)果趨勢一致,ApoCI蛋白在T1組的表達水平比C1組的高66%,在T2組的表達水平比C1組高22%,在T3組的表達水平比C1組高82%,組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);ApoCIII蛋白在T1組的表達水平比C1組低45%,在T2組的表達水平比C1組低62%,在T3組的表達水平比C1組低5%,組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);ApoCIV蛋白在T1組的表達水平是C1組的14.57倍,在T2組的表達水平是C1組的11.0倍,在T3組的表達水平是C1組的14.84倍,組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);研究結(jié)論:1.對于少量高二惡英濃度的大鼠血清樣本,CBG2.8D生物檢測較為適宜的前處理方式是正己烷和異丙醇的有機溶劑萃取法搭配酸性硅膠柱過柱的凈化濃縮方法。其檢測結(jié)果與高分辨檢測法結(jié)果相近。對于氯化工廠工人的血清樣本,CBG2.8D生物檢測法的檢測結(jié)果與HRGC-HRMS高分辨法的檢測結(jié)果差異顯著,不能認(rèn)為來自同一總體。推測原因:(1)血清中某些非二惡英類化合物成分也會激活芳香烴受體通路產(chǎn)生響應(yīng),由于CBG2.8D生物檢測法檢測原理依賴的是AhR通路的激活,所以其結(jié)果直接表現(xiàn)為AhR通路的響應(yīng)程度,而大鼠的培養(yǎng)及染毒環(huán)境基本完全可控,但是氯化工廠工人的生活環(huán)境更為復(fù)雜,暴露因素不完全可控,血清中可能含有其他未知的可激活A(yù)hR信號通路的物質(zhì),導(dǎo)致CBG2.8D生物檢測法所推導(dǎo)出的血清內(nèi)總TEQ與HRGC-HRMS高分辨法的檢測結(jié)果差異較大。(2)由于本次研究使用的人類血清樣本量較低(0.5mL),不能多次進行重復(fù)實驗,可能會存在偏倚相對較大的情況,導(dǎo)致檢測結(jié)果不具有相關(guān)性。如果進一步加大檢測樣本量,檢測結(jié)果可能會有所改善。2.ApoCI、ApoCIII、ApoCIV在三個暴露組中均呈現(xiàn)出低暴露和高暴露組的蛋白表達量高于中暴露組;在暴露組和清潔對照組中,ApoCI、ApoCIV的表達量暴露組高于對照組,ApoCIII的表達量暴露組低于清潔對照組。ApoCI、ApoCIV是脂質(zhì)代謝相關(guān)疾病發(fā)生的危險因素,ApoCIII是脂質(zhì)代謝相關(guān)疾病發(fā)生的保護因素。由此可以推測,二惡英類化合物的暴露會增加某些脂質(zhì)代謝相關(guān)疾病的發(fā)生率。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R114
【圖文】：

圖 1 酸性硅膠柱的裝填示意品萃取液加入硅膠柱中，柱子下方用雞心瓶盛接洗脫液，然洗串聯(lián)柱，待柱中液面下降到硫酸鈉層水平時，再次加入 10復(fù)此過程 3 次。盛有洗脫液雞心瓶安裝在旋蒸儀上進行濃縮，待瓶內(nèi)液體蒸體轉(zhuǎn)移至 GC 管進行氮吹，并用 1mL 正己烷潤洗雞心瓶后過程重復(fù)三次。：待氮吹至管內(nèi)液面水平穩(wěn)定后，加入 10μL 的 DMSO 定中避光冷藏保存。有機溶劑轉(zhuǎn)換成 DMSO 時，必須將有機免有機溶劑對細(xì)胞的影響。理方案閱相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)，酸洗法和復(fù)合層析柱與法均可以作為 CB前處理方式，且兩種方式的檢測值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0取后，分別采用酸性硅膠柱過柱和酸洗法兩種方式進行前處，進一步對兩者進行比較。處理步驟如圖 2 所示：

圖 2 血清前處理流程示意圖鼠血清蛋白的變性：向 0.5mL 大鼠血清中加入 0.5mL 異丙醇，渦旋一分鐘，大鼠血清與異丙醇充分混合，將血清蛋白完全變性沉淀。萃�。合蚧旌弦褐屑尤� 1mL 正己烷，渦旋一分鐘，充分萃取血清中的脂質(zhì)，置待分層后，取上清液，此過程重復(fù)三次。.樣品的凈化濃縮：性硅膠柱法：將上清液加入已經(jīng)如圖裝填好的硅膠柱，并分三次加入 10mL 正烷洗脫。將洗脫液旋蒸氮吹，最后加入 10μlDMSO 定容備用。洗法：向上清液中加入 2mL 濃硫酸，充分震蕩混合，靜止后取上清液重復(fù) 3-5，目的是除去樣品中的不穩(wěn)定物質(zhì)。向酸洗完畢后的溶液中加入 2M 的氯化鈉液震蕩水洗 3-5 次，目的是去除殘余的 濃硫酸，最后將上清液分離，旋蒸氮，加入 10μlDMSO 定容備用。經(jīng)過多次實驗后發(fā)現(xiàn)，酸洗法由于使用的試劑濃硫酸酸性很強，多次洗滌

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