本文關(guān)鍵詞：三氯乙烯抑制人胚胎干細(xì)胞向心肌分化的機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:探討三氯乙烯(TCE)對(duì)人胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的影響及其機(jī)制。方法:以人胚胎干細(xì)胞H9體外心肌定向分化為基礎(chǔ),培養(yǎng)液中添加不同劑量的TCE(處理組分別為:100 ppb組,1 ppm組,10 ppm組)以及二甲基亞砜(DMSO,對(duì)照組)。對(duì)誘導(dǎo)后形成的擬胚體以及不同發(fā)育階段的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè):MTT法測(cè)定細(xì)胞生存力,直觀統(tǒng)計(jì)擬胚體自主節(jié)律性搏動(dòng)次數(shù),流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)分析細(xì)胞分化比例,熒光定量PCR檢測(cè)心肌特異性基因表達(dá),免疫熒光法檢測(cè)各個(gè)時(shí)期相關(guān)蛋白表達(dá),基因芯片法觀察TCE對(duì)心肌細(xì)胞鈣離子通道相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果:1.胚胎干細(xì)胞向心肌成功定向分化隨著時(shí)間的推移,細(xì)胞依次經(jīng)過多能干細(xì)胞期,擬胚體懸浮期以及自發(fā)節(jié)律性搏動(dòng)的貼壁擬胚體形成期�？梢杂^測(cè)到胚胎干細(xì)胞(ESC)形態(tài)發(fā)生變化,用階段特異性標(biāo)記物作RT-PCR,結(jié)果顯示心肌細(xì)胞分化成功。2.TCE的細(xì)胞毒性作用MTT法顯示,所檢測(cè)的濃度對(duì)于未分化的胚胎干細(xì)胞和終末分化的心肌細(xì)胞的細(xì)胞活性均不產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性作用(n=12,P0.05)。說明所用劑量的TCE本身不影響細(xì)胞活性。3.TCE抑制人胚胎干細(xì)胞的心肌定向分化隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),觀測(cè)到的擬胚體搏動(dòng)數(shù)目增加,自發(fā)搏動(dòng)擬胚體發(fā)生的時(shí)間比對(duì)照組向后推移,流式細(xì)胞檢測(cè)顯示,隨著TCE濃度增加,心肌特異性標(biāo)志物cTnt的陽性率不斷降低,表明TCE對(duì)于心肌分化的抑制具有明顯的劑量依賴性。收集培養(yǎng)D21的各組劑量處理的細(xì)胞,用免疫熒光法檢測(cè)cTnt蛋白表達(dá),結(jié)果顯示細(xì)胞受累區(qū)域明顯增大。4.TCE抑制心肌分化階段標(biāo)志物的表達(dá)TCE對(duì)于多能基因Nanog、Tert和Sox2、中胚層形成相關(guān)基因Gata4和T的表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響(P0.05)。但TCE能夠顯著影響成熟期心肌標(biāo)志物cTnt和Mhy-7的表達(dá)水平,并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性下調(diào),說明TCE影響心肌細(xì)胞從心肌前體期到成熟心肌分化的轉(zhuǎn)變。5.TCE對(duì)心肌鈣離子通道相關(guān)基因表達(dá)的影響q-PCR結(jié)果顯示鈣離子通道相關(guān)基因Serca2和Cav1.2表達(dá)水平顯著下調(diào),說明TCE干擾心肌細(xì)胞鈣離子通道基因的表達(dá)。將具有自主性節(jié)律搏動(dòng)的心肌細(xì)胞進(jìn)行芯片分析,發(fā)現(xiàn)這些能夠自主搏動(dòng)的細(xì)胞其鈣離子通道相關(guān)基因的數(shù)目總體呈現(xiàn)下調(diào)。結(jié)論:三氯乙烯抑制心臟祖細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化過渡,降低成熟心肌分化的比例,干擾Ca2+通道相關(guān)基因的表達(dá),造成心肌細(xì)胞分化發(fā)育障礙及其自發(fā)搏動(dòng)低下。
【關(guān)鍵詞】：三氯乙烯 人胚胎干細(xì)胞 心肌分化 基因表達(dá) 鈣離子通道相關(guān)基因
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R114
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 引言10-16
• 實(shí)驗(yàn)材料與方法16-25
• 一.實(shí)驗(yàn)材料16-17
• （一）實(shí)驗(yàn)細(xì)胞16
• （二）主要試劑16-17
• （三）主要儀器17
• 二、實(shí)驗(yàn)方法17-25
• （一）飼養(yǎng)層細(xì)胞-MEFs（成纖維細(xì)胞）培養(yǎng)17-19
• （二）人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)和分化19-21
• （三）自發(fā)節(jié)律性搏動(dòng)EBs的數(shù)量和搏動(dòng)頻率測(cè)定21
• （四）MTT測(cè)定細(xì)胞活性21-22
• （五）流式細(xì)胞分析分化比例22
• （六）免疫熒光檢測(cè)心肌蛋白表達(dá)22-23
• （七）心肌分化基因表達(dá)檢測(cè)23-24
• （八）心肌鈣離子通道相關(guān)的基因表達(dá)檢測(cè)24
• （九）統(tǒng)計(jì)分析24-25
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-32
• 一、胚胎干細(xì)胞向心肌定向分化25-26
• 二、TCE對(duì)細(xì)胞活性和心肌分化的影響26-29
• 三、TCE抑制心肌分化階段標(biāo)志物的表達(dá)29-30
• 四、TCE對(duì)心肌鈣離子通道相關(guān)基因表達(dá)的影響30-32
• 討論32-36
• 結(jié)論和展望36-37
• 參考文獻(xiàn)37-44
• 綜述44-58
• 參考文獻(xiàn)53-58
• 縮略詞表58-60
• 攻讀學(xué)位期間公開發(fā)表的論文60-61
• 致謝61-62

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張惠敏;三氯乙烯生產(chǎn)及應(yīng)用現(xiàn)狀[J];中國(guó)氯堿;2004年08期

  本文關(guān)鍵詞：三氯乙烯抑制人胚胎干細(xì)胞向心肌分化的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：268998