本文關鍵詞：分子氫在電離輻射防護作用中的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景:2007年日本醫(yī)科大學Ohsawa[1]等研究發(fā)現(xiàn)氫氣具有很強抗氧化性。這一發(fā)現(xiàn),使氫氣迅速成為了學術界的研究熱點。目前,已經研究并報道分子氫對多種器官和組織的多種疾病具有較好的防護和治療作用,對分子氫生物學作用的研究還在不斷深入[2,3]。本實驗室在對分子氫生物學作用的研究中率先發(fā)現(xiàn),分子氫對電離輻射損傷有著較好的防護作用。目前已經發(fā)現(xiàn)并報道了分子氫對受照細胞、造血組織、心血管組織、生殖系統(tǒng)及整體動物等均有十分顯著的防護效果[4-8]。在日本學者Ohsawa研究中,通過實驗證實分子氫是通過選擇性清除·OH和ONOO-來發(fā)揮其抗氧化作用。然而,隨著對分子氫研究的不斷深入,愈來愈多的實驗結果已無法用單純的選擇性清除自由基來解釋。多個研究提示,分子氫或許影響了機體某些信號傳導通路或是基因的表達。那么,在電離輻射損傷防護當中,分子氫又是通過何種途徑發(fā)揮其生物學作用呢?闡明分子氫發(fā)揮生物學活性的機制問題,會為其在生物醫(yī)學領域的更廣泛應用提供理論依據(jù),并能促使其能好的向臨床應用轉化。因此,本研究主要圍繞著分子氫在電離輻射損傷防護中的分子機制而開展。本課題主要分為三個部分。第一部分研究分子氫在無細胞體系中中和多種自由基的能力。第二部分研究以機體內重要抗氧化酶為研究對象,檢測分子氫是否對其活性產生影響。第三部分探討Nrf2/ARE信號通路在分子氫輻射防護效應中的作用。研究內容:1、分子氫對多種自由基的清除作用:通過不同的化學體系中分別產生不同的自由基,使用電子自旋共振技術檢測加入分子氫之后各種自由基含量的變化。2、分子氫對機體重要抗氧化酶的影響:研究分子氫在無細胞體系中對抗氧化酶活性的影響;檢測分子氫對L-02細胞內抗氧化酶活性的影響3、Nrf2/ARE信號通路在分子氫輻射防護效應中的作用:建立分子氫細胞輻射防護模型,明確防護效果。脂質體轉染si Nrf2,觀察干擾Nrf2后分子氫對電離輻射損傷的防護效果,對結果分析和討論。實驗方法:1、光照核黃素生成,使用ESR檢測加入分子氫其含量的變化2、使用ESR檢測加入分子氫后DPPH自由基含量的變化3、光照血卟啉產生單線態(tài)氧,利用ESR檢測加入分子氫后單線態(tài)氧含量的變化4、使用比色法檢測分子氫對多種抗氧化酶活性的影響5、L-02細胞給予4Gy和8Gy 60Coγ射線照射,檢測給氫對照后細胞的凋亡率及細胞活力的影響,驗證分子氫對L-02細胞的輻射防護作用6、使用Western blot檢測分子氫對照后細胞Nrf2蛋白表達量的影響7、使用PCR檢測分子氫對照后細胞Nrf2 m RNA表達含量的影響8、利用lipo2000轉染si Nrf2干擾L-02細胞中Nrf2的表達,在RNA及蛋白水平檢測轉染效果9、干擾Nrf2后檢測酶活性,探討干擾Nrf2后分子氫對照后細胞抗氧化酶活性的影響10、干擾Nrf2,檢測照后L-02細胞的凋亡情況和細胞活力,評價干擾后分子氫對細胞輻射損傷的防護效應。實驗結果:1、在無細胞體系中產生多種自由基,使用ESR檢測,加氫組與對照組自由基含量無明顯差異,提示分子氫在無細胞體系中不能與其直接發(fā)生反應,對其無明顯清除作用;2、在純化的SOD及CAT溶液中直接通入氫氣,檢測分子氫對抗氧化酶的直接作用。結果提示,分子氫對酶活性沒有直接影響。3、予以L-02 4Gyγ射線照射,照后24h,檢測各個實驗組細胞抗氧化酶活性的影響。結果提示:分子氫可以顯著提高照射后細胞內SOD、CAT及GSH-PX的活性。4、予以L-02 4Gy和8Gyγ射線照射,照后24h,檢測細胞凋亡情況和細胞活力,結果為:細胞凋亡率和細胞活力呈劑量依賴性變化,與照射組相比,加氫組能顯著降低照后細胞凋亡率及提高照后細胞活力,證明分子氫可以防護電離輻射對L-02細胞造成的損傷;5、予以L-02 4Gyγ射線照射,照后4h提取細胞RNA,檢測Nrf2 m RNA的變化,結果為:各組之間m RNA含量無明顯差異;6、予以L-02 4Gy照射,照后6h提取總蛋白,檢測Nrf2蛋白水平的變化,結果為:給氫組Nrf2蛋白量明顯增加,提示分子氫可以激活Nrf2;7、lipo2000轉染si Nrf2,結果為:Nrf2 m RNA和蛋白水平的表達均明顯下調,轉染效果良好;8、干擾Nrf2后,予以L-02 4Gy照射,照后24h檢測抗氧化酶的活性,結果發(fā)現(xiàn)抗氧化酶的活性明顯下降;9、干擾Nrf2后,予以L-02 4Gy照射,照后24h檢測細胞凋亡率和細胞活力,結果為:分子氫對照后細胞凋亡率和細胞活力無明顯影響,提示干擾后分子氫對輻射損傷的保護作用下降。討論與分析:近年來,國內外的眾多研究發(fā)現(xiàn),分子氫對多種疾病具有十分顯著的防治作用。本實驗室在對分子氫生物學效應的研究中,率先發(fā)現(xiàn)并報道了分子氫對電離輻射損傷的防治作用。目前,對于分子氫的研究,大多數(shù)停留在效應層面,有關分子氫作用機制仍不清楚。在前期對分子氫研究的基礎上,我們考慮通過以下方面來探討分子氫的作用機制:1、研究分子氫在無細胞體系中中和多種自由基的能力。2、以機體內重要抗氧化酶為研究對象,檢測分子氫是否對其活性產生影響。3、探討Nrf2/ARE信號通路在分子氫輻射防護效應中的作用。經研究我們發(fā)現(xiàn),在利用ESR對自由基含量的檢測中,并未觀察到加氫組自由基含量有明顯變化,提示在無細胞體系中分子氫對所研究的自由基并無明顯的清除作用。在對抗氧化酶的研究中,我們觀察到分子氫與酶之間的直接相互作用并不能影響其活性。而分子氫可以顯著提高照后L-02細胞內抗氧化酶的活性。在此基礎上。我們對Nrf2信號通路進行了研究,發(fā)現(xiàn)分子氫可以明顯上調照后細胞Nrf2的蛋白水平。進一步地,我們對Nrf2進行了干擾實驗,觀察到在干擾Nrf2之后,照后被分子氫上調的多種抗氧化酶不再升高,同時,分子氫對L-02的輻射防護效應也顯著下降。這些結果提示,分子氫可能通過激活Nrf2/ARE信號通路發(fā)揮其防護輻射損傷的作用。結論:1、分子氫在無細胞體系中,對所檢測自由基沒有明顯的清除作用;2、分子氫可以明顯提高照后細胞抗氧化酶活性;3、Nrf2/ARE信號通路在分子氫防護輻射損傷中發(fā)揮著重要作用。
【關鍵詞】：電離輻射(IR) 分子氫(hydrogen) 自由基(free radical) Nrf2
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R142
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 縮略詞表11-12
• 前言12-15
• 第一部分 分子氫對多種自由基的清除作用15-23
• 一、材料15-16
• 二、方法16-18
• 三、結果18-22
• 四、討論22-23
• 第二部分 分子氫對抗氧化酶的影響23-31
• 一、材料23-24
• 二、方法24-27
• 三、結果27-30
• 四、討論30-31
• 第三部分 Nrf2 在分子氫對L 02 細胞輻射防護作用中的機制研究31-47
• 一、材料31-34
• 二、方法34-38
• 三、結果38-45
• 四、討論45-47
• 全文總結47-49
• 參考文獻49-51
• 文獻綜述51-64
• 參考文獻58-64
• 在讀期間發(fā)表論文情況64-65
• 致謝65

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本文編號：267121