【摘要】：鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)是鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)中最常使用的增塑劑,廣泛應(yīng)用于食品包裝材料、醫(yī)療器械、兒童玩具等,可通過多種途徑進(jìn)入人體。DEHP攝入機(jī)體后,可在肝臟和小腸細(xì)胞中迅速代謝成其水解產(chǎn)物鄰苯二甲酸單-2-乙基己酯(mono-(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP),DEHP對(duì)機(jī)體的毒性作用主要通過MEHP實(shí)現(xiàn)。作為一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrine disruptor,EEDs),DEHP暴露可對(duì)生物體生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等多個(gè)組織系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用。流行病學(xué)研究和毒理學(xué)研究表明DEHP暴露可影響機(jī)體脂代謝,誘發(fā)肥胖;MEHP對(duì)3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用,能夠促使3T3-L1細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞,增加細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積,但其作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過體外培養(yǎng)3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞并給予DEHP代謝產(chǎn)物MEHP暴露,分析MEHP暴露對(duì)3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞分化和脂代謝的影響,探討脂代謝相關(guān)信號(hào)通路和脂代謝關(guān)鍵基因在MEHP暴露影響3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞分化和脂代謝中的作用和機(jī)制,可為防治環(huán)境內(nèi)分泌干擾物所致人群脂代謝相關(guān)疾病提供理論依據(jù)。第一部分MEHP對(duì)3T3-L1細(xì)胞分化和脂代謝的影響目的:明確MEHP對(duì)3T3-L1細(xì)胞分化和脂代謝的影響,探討脂代謝關(guān)鍵基因在MEHP影響3T3-L1細(xì)胞分化中的作用。方法:使用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞,給予3T3-L1細(xì)胞梯度MEHP暴露。MTT法檢測(cè)3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞存活率;根據(jù)MTT結(jié)果確定染毒劑量與實(shí)驗(yàn)分組。暴露劑量與分組:空白對(duì)照(0μM MEHP),溶劑對(duì)照組(0.25‰DMSO,0μM MEHP),低劑量組(10μM MEHP),中劑量組(50μM MEHP)和高劑量組(250μM MEHP)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期、細(xì)胞內(nèi)活性氧以及線粒體膜電位的改變;采用經(jīng)典激素雞尾酒方法進(jìn)行3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn),并在分化過程中持續(xù)給予不同劑量MEHP暴露;油紅O染色觀察3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞分化程度;化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)甘油三酯、膽固醇水平;實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)脂代謝關(guān)鍵基因Acox-1、C/EBPβ、FABP4、FAS、LPL、PDK4、PPARγm RNA表達(dá)水平;western blot方法檢測(cè)脂代謝調(diào)控因子Acox-1、C/EBPβ、FABP4、FAS、LPL、PDK4、PPARγ的表達(dá)水平。采用IBM SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果:1.3T3-L1細(xì)胞暴露于63,125,250,500μM MEHP 24 h后,細(xì)胞存活率明顯高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.各劑量MEHP組3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞周期無明顯改變(P0.05);與對(duì)照組相比,中、高劑量組3T3-L1細(xì)胞活性氧含量顯著升高(P0.05),線粒體膜電位顯著降低(P0.05)。3.誘導(dǎo)分化過程中可見,3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞體積增大、形態(tài)變圓、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)反光脂滴,細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量隨MEHP暴露劑量增加而升高(P0.05);分化結(jié)束后,中、高劑量組細(xì)胞中甘油三酯含量明顯高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P0.05)。4.3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化后,MEHP暴露組中Acox-1 m RNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P0.05),中、高劑量組中Acox-1 m RNA表達(dá)顯著高于低劑量組(P0.05);中劑量MEHP暴露組中FABP4和PDK4 m RNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組,高劑量組FABP4 m RNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他各組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);高劑量組FAS和C/EBPβm RNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他各組(P0.05);3T3-L1細(xì)胞中PPARγm RNA的相對(duì)表達(dá)量隨著MEHP暴露劑量的增加而增加(P0.05)。5.3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化后,低、中、高劑量組中的Acox-1蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P0.05),中、高劑量組中Acox-1蛋白表達(dá)顯著高于低劑量組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);中、高劑量MEHP暴露組中C/EBPβ蛋白的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P0.05);中劑量MEHP暴露組中FABP4蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組,高劑量組FABP4蛋白表達(dá)量顯著高于其他各組(P0.05);中劑量MEHP暴露組FAS蛋白表達(dá)水平顯著高于其他各組(P0.05);中劑量MEHP暴露組LPL和PDK4蛋白表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),中、高劑量MEHP暴露組PPARγ蛋白的表達(dá)量顯著高于低劑量組和對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.MEHP暴露能夠促進(jìn)3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞的增殖、分化和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。2.MEHP暴露能夠改變3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞線粒體膜電位和細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平影響線粒體功能。3.MEHP暴露可通過上調(diào)Acox-1、C/EBPβ、FAS、FABP4、LPL、PDK4和PPARγ基因m RNA及其蛋白的表達(dá)影響脂代謝。第二部分MEHP對(duì)3T3-L1細(xì)胞脂代謝相關(guān)信號(hào)通路的影響目的:明確MEHP暴露對(duì)3T3-L1細(xì)胞脂代謝相關(guān)信號(hào)通路JAK-STAT信號(hào)通路和及Notch信號(hào)通路基因表達(dá)的影響,探討JAK-STAT信號(hào)通路和Notch信號(hào)通路在MEHP影響3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化和脂代謝中的作用。方法:3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)分組以及甘油三酯、膽固醇水平檢測(cè)同第一部分。Real-time-PCR方法檢測(cè)JAK-STAT信號(hào)通路中JAK-1、JAK-2、JAK-3、TYK-2、STAT-1、STAT-3、STAT-5a和STAT-5b m RNA的表達(dá)水平,以及Notch信號(hào)通路中Notch-1、Notch-2、Notch-3、Notch-4及其配體Dll-1、Dll-4、Jagged-1、Jagged-2 m RNA表達(dá)水平;western Blot方法檢測(cè)JAK-STAT信號(hào)通路中JAK-1、JAK-2、JAK-3、TYK-2、STAT-1、STAT-3、STAT-5a以及STAT-5b的蛋白表達(dá)水平,以及Notch信號(hào)通路中Notch-1、Notch-2、Notch-3、Notch-4及其配體Dll-1、Dll-3、Jagged-1以及Jagged-2蛋白表達(dá)水平。采用IBM SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果:1.3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化后,高劑量組細(xì)胞JAK-2、JAK-3 m RNA表達(dá)顯著低于其余各組(P0.05);與對(duì)照組相比,MEHP暴露組細(xì)胞TYK-2 m RNA表達(dá)顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),中、高劑量組TYK-2 m RNA表達(dá)水平顯著高于低劑量組(P0.05);高劑量組STAT-1 m RNA表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組(P0.05);MEHP暴露組STAT-3 m RNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P0.05);中、高劑量組中STAT-3 m RNA表達(dá)明顯高于低劑量組(P0.05);高劑量組STAT-5a m RNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組和低劑量組(P0.05)。2.誘導(dǎo)分化后,高劑量組3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞中JAK-1蛋白表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);MEHP暴露組細(xì)胞TYK-2蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P0.05);中、高劑量組TYK-2蛋白表達(dá)顯著高于低劑量組(P0.05);MEHP暴露組細(xì)胞STAT-3、STAT-5a蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P0.05),中、高劑量組STAT-3、STAT-5a表達(dá)水平顯著高于低劑量組(P0.05);中、高劑量組中STAT-5b表達(dá)水平顯著升高(P0.05),高劑量組STAT-5b蛋白表達(dá)水平最高(P0.05)。3.JAK-STAT信號(hào)通路基因表達(dá)水平與甘油三酯水平的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)分化后3T3-L1細(xì)胞中甘油三酯的含量與TYK-2、STAT-3、STAT-5a m RNA和蛋白表達(dá)水平顯著相關(guān)(P0.05)。4.3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化后,中劑量組細(xì)胞Notch-1 m RNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P0.05),高劑量組Notch-1 m RNA顯著高于其余各組(P0.05);Notch-3、Notch-4 m RNA表達(dá)水平隨著MEHP暴露劑量升高而呈上升趨勢(shì),高劑量組顯著高于其余各組(P0.05);中劑量組細(xì)胞Jagged-1 m RNA表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組(P0.05);中、高劑量組與對(duì)照組相比,3T3-L1細(xì)胞Jagged-2m RNA表達(dá)明顯上升(P0.05),高劑量組Jagged-2 m RNA表達(dá)顯著高于低劑量組(P0.05);高劑量組Dll-4 m RNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其余各組(P0.05)。5.誘導(dǎo)分化后的3T3-L1細(xì)胞,高劑量組細(xì)胞Notch-2蛋白表達(dá)顯著高于其余各組(P0.05);中劑量組的Jagged-1表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組(P0.05);高劑量組細(xì)胞Jagged-2蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P0.05);高劑量組Dll-1蛋白表達(dá)水平相助高于其余各組;高劑量組與低劑量組Dll-4蛋白表達(dá)量顯著升高(P0.05)。6.JAK-STAT信號(hào)通路和Notch信號(hào)通路基因m RNA和蛋白表達(dá)水平與3T3-L1細(xì)胞內(nèi)TG含量的相關(guān)性研究結(jié)果顯示,誘導(dǎo)分化后3T3-L1細(xì)胞內(nèi)TG含量與JAK-STAT信號(hào)通路TYK-2、STAT-3、STAT-5a m RNA及其蛋白表達(dá)水平顯著相關(guān);與Notch信號(hào)通路Notch-1、Jagged-2 m RNA表達(dá)水平顯著相關(guān)(P0.05)。結(jié)論:1.MEHP暴露可影響JAK-STAT信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白的表達(dá),影響3T3-L1細(xì)胞分化成熟和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。2.MEHP暴露后3T3-L1細(xì)胞中TG含量與JAK-STAT信號(hào)通路中TYK-2、STAT-3、STAT-5a m RNA及其蛋白表達(dá)密切相關(guān)。3.MEHP暴露可影響Notch信號(hào)通路中基因和蛋白表達(dá),影響3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞分化成熟和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。4.MEHP暴露后3T3-L1細(xì)胞中TG含量與Notch信號(hào)通路中Notch-1、Jagged-2 m RNA及其蛋白表達(dá)密切相關(guān)。第三部分STAT-3在MEHP影響3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞分化和脂代謝中的作用及其機(jī)制目的:構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞STAT-3沉默細(xì)胞株;明確JAK-STAT信號(hào)通路中STAT-3在MEHP影響3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)水平中的作用;探討STAT-3在MEHP所致脂代謝紊亂中的作用機(jī)制。方法:采用STAT-3沉默慢病毒(Lv/sh-STAT-3)、非沉默慢病毒(Lv/sh-NC)分別感染3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞,構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞STAT-3沉默細(xì)胞株。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法以及western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中STAT-3的沉默效率。采用經(jīng)典激素雞尾酒法對(duì)正常3T3-L1細(xì)胞和Lv/sh-NC、Lv/sh-STAT-3穩(wěn)轉(zhuǎn)3T3-L1細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化,并給予不同處理。實(shí)驗(yàn)分組為:親本對(duì)照組(Parental)為0μM MEHP,非沉默感染組(Lv/sh-NC)為0μM MEHP,STAT-3沉默組(Lv/shSTAT-3)為0μM MEHP,暴露組包括250μM MEHP暴露STAT-3沉默組(Lv/shSTAT-3+MEHP)和250μM MEHP暴露非沉默感染組(Lv/sh-NC+MEHP)。油紅O染色觀察3T3-L1細(xì)胞分化程度;化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)甘油三酯、膽固醇水平;實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)脂代謝調(diào)控因子Acox-1、C/EBPβ、FABP4、FAS、LPL、PDK4、PPARγm RNA表達(dá)水平;western blot方法檢測(cè)脂代謝調(diào)控因子Acox-1、C/EBPβ、FABP4、FAS、LPL、PDK4、PPARγ的表達(dá)水平。結(jié)果:1.STAT-3沉默慢病毒(Lv/sh-STAT-3)以及非沉默慢病毒(Lv/sh-NC)感染3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞后,感染效率較高,感染效果較好。2.Lv/sh-NC組細(xì)胞內(nèi)STAT-3 m RNA和蛋白表達(dá)水平與Parental組相比均無明顯變化(P0.05),Lv/sh-STAT-3組STAT-3 m RNA及其蛋白表達(dá)水平均顯著低于Parental組和Lv/sh-NC組(P0.05)。3.Lv/sh-STAT-3組3T3-L1細(xì)胞內(nèi)TG含量略低于Parental組和Lv/sh-NC組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);Lv/sh-STAT-3+NC組和Lv/sh-STAT-3+MEHP組3T3-L1細(xì)胞中TG含量明顯高于非暴露Parental組、Lv/sh-NC組和Lv/sh-STAT-3組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而Lv/sh-STAT-3+MEHP組細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯低于Lv/sh-NC+MEHP組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.Lv/sh-NC和Lv/sh-STAT-3組細(xì)胞內(nèi)Acox-1、FAS、FABP4、LPL、PDK4m RNA表達(dá)水平與Parental組相比未發(fā)生明顯變化(P0.05)。Lv/sh-NC+MEHP組和Lv/sh-STAT-3+MEHP組中Acox-1、FAS、FABP4、LPL、PDK4 m RNA表達(dá)水平明顯高于Parental組、Lv/sh-NC組和Lv/sh-STAT-3組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.與Parental組相比,Lv/sh-NC組細(xì)胞C/EBPβ基因m RNA表達(dá)水平未發(fā)生明顯變化(P0.05),而Lv/sh-STAT-3組與Parental組和Lv/sh-NC組相比,細(xì)胞內(nèi)C/EBPβm RNA表達(dá)水平顯著降低(P0.05);Lv/sh-NC+MEHP組和Lv/shSTAT-3+MEHP組細(xì)胞C/EBPβm RNA表達(dá)水明顯高于Parental組、Lv/sh-NC組和Lv/sh-STAT-3組(P0.05),而Lv/sh-STAT-3+MEHP組C/EBPβm RNA表達(dá)水平明顯低于Lv/sh-NC+MEHP組(P0.05)。與Parental組比較,Lv/sh-NC組細(xì)胞PPARγm RNA表達(dá)水平無明顯變化(P0.05);而Lv/sh-STAT-3組細(xì)胞PPARγm RNA表達(dá)水平顯著低于Parental組和Lv/sh-NC組(P0.05);與非暴露Lv/sh-NC組和Lv/sh-STAT-3組相比,Lv/sh-NC+MEHP組和Lv/sh-STAT-3+MEHP組內(nèi)的PPARγm RNA表達(dá)水平顯著升高(P0.05);而Lv/sh-STAT-3+MEHP組的PPARγm RNA表達(dá)水平顯著低于Lv/sh-NC+MEHP組(P0.05)。6.與Parental組相比,Lv/sh-NC組和Lv/sh-STAT-3組細(xì)胞Acox-1、FABP4、FAS、PDK4和C/EBPβ、PPARγ蛋白表達(dá)水平未發(fā)生明顯變化;而MEHP暴露后,Lv/sh-NC+MEHP組和Lv/sh-STAT-3+MEHP組內(nèi)的Acox-1、FABP4、FAS、PDK4和C/EBPβ、PPARγ蛋白表達(dá)水平顯著升高(P0.05)。結(jié)論:1.采用STAT-3沉默慢病毒(Lv/sh-STAT-3)成功構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞STAT-3沉默細(xì)胞株。2.STAT-3能夠促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞分化成熟和內(nèi)脂質(zhì)蓄積3.MEHP可能通過STAT-3調(diào)節(jié)脂代謝關(guān)鍵基因C/EBPβ和PPARγm RNA及其蛋白的表達(dá)水平在所致脂代謝紊亂中發(fā)揮作用。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R114

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本文編號(hào)：2654908