【摘要】：目的1初步探索Nrf2信號通路在t-BHP致HEI-OC1細(xì)胞氧化損傷中的作用。2探討原花青素在t-BHP致HEI-OC1細(xì)胞氧化損傷中的作用及機制。方法1采用t-BHP染毒HEI-OC1細(xì)胞,設(shè)置對照組與50μM、100μM、200μM三個染毒組,于染毒12h后分別檢測細(xì)胞生存率(CCK-8法)、檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平(流式細(xì)胞術(shù))及細(xì)胞凋亡率,驗證氧化損傷模型是否構(gòu)建成功。2進行實時熒光定量PCR試驗,檢測氧化損傷模型下HEI-OC1細(xì)胞中Nrf2、HO-1、GSTα1、GCLC、GCLM、NQO1 m RNA的表達水平。3應(yīng)用Western Blot試驗檢測氧化損傷模型下HEI-OC1細(xì)胞中HO-1、Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3蛋白的表達水平。4使用CCK-8法進行細(xì)胞毒性試驗,分別觀察原花青素對正常狀態(tài)下HEI-OC1細(xì)胞生存率的影響以及原花青素對氧化損傷模型下HEI-OC1細(xì)胞生存率的影響,從而篩選出較適宜的原花青素作用時間及藥物濃度。5對原花青素干預(yù)后的HEI-OC1細(xì)胞進行流式細(xì)胞試驗,用DCFH-DA探針法檢測HEI-OC1細(xì)胞內(nèi)ROS水平,Annexin V-FITC/PI雙染法檢測HEI-OC1細(xì)胞凋亡情況。6對原花青素干預(yù)后的HEI-OC1細(xì)胞進行實時熒光定量PCR試驗,分別檢測HEI-OC1細(xì)胞中Nrf2、HO-1、GSTα1、GCLC、GCLM、NQO1 m RNA的表達水平。7通過Western Blot試驗檢測原花青素干預(yù)后的HEI-OC1細(xì)胞中HO-1、Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3蛋白的表達水平。結(jié)果1 CCK8檢測結(jié)果顯示隨著t-BHP染毒濃度的增加,細(xì)胞的增殖能力呈明顯的下降趨勢(F=322.8,P0.001)。DCFH-DA探針標(biāo)記和Annexin-V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示隨著t-BHP染毒濃度的增加,細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加,細(xì)胞的早期凋亡率與晚期凋亡率也呈一定的升高趨勢。2 RT-PCR結(jié)果表明,HO-1、GCLC、GST-α1基因表達水平升高,并隨著t-BHP染毒濃度的增加,基因表達水平呈現(xiàn)一定的升高趨勢;Nrf2、GCLM基因表達水平在200μM時有統(tǒng)計學(xué)差異(F=10.39,P0.01;F=13.33,P0.01);NQO1基因表達水平升高,但僅在100μM時有統(tǒng)計學(xué)差異(F=4.77,P0.05)。3 Western Blot結(jié)果表明,cleaved-caspase-3、Bax、HO-1蛋白表達的水平隨著t-BHP染毒濃度的增加呈現(xiàn)一定的升高趨勢(P0.05),Bcl-2蛋白表達水平降低。4 CCK8法檢測細(xì)胞存活率,結(jié)果顯示,與對照組相比,0-20mg/L的原花青素(PC)對細(xì)胞存活率無明顯改變,而40、80mg/L的原花青素顯著降低細(xì)胞存活率(85.66±3.0,39.74±2.04,F=311.3,P0.001)。在氧化損傷細(xì)胞模型中,加入不同濃度PC干預(yù)6、12、24h后,干預(yù)12h時,不同濃度的PC對細(xì)胞保護作用呈現(xiàn)一定的增強趨勢,20mg/L PC對細(xì)胞保護作用相對較大(F=26.23,P0.001)。5 DCFH-DA探針標(biāo)記和Annexin-V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,原花青素干預(yù)后,原花青素各組(5、10、20mg/L)細(xì)胞內(nèi)ROS熒光Mean值分別是損傷組的0.82倍(P0.05)、0.70倍(P0.001)、0.56倍(P0.001)。原花青素各組(5、10、20mg/L)凋亡區(qū)細(xì)胞分別為損傷組的0.55倍(P0.001)、0.64倍(P0.001)、0.85倍(P0.05)。6 RT-PCR結(jié)果表明,給予原花青素干預(yù)后,僅HO-1、GCLM、GST-α1 m RNA表達水平升高,且在低濃度干預(yù)下有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。與損傷組相比,NQO1、GCLC、Nrf2 m RNA隨著干預(yù)濃度的增加呈現(xiàn)一定的降低趨勢。7 Western Blot結(jié)果表明,原花青素干預(yù)后Bcl-2、HO-1蛋白表達的水平隨著染毒濃度的增加呈一定的升高趨勢(P0.05),cleaved-caspase-3、Bax蛋白表達水平降低。結(jié)論1 t-BHP可誘導(dǎo)HEI-OC1細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。2 t-BHP通過激活Nrf2/ARE信號通路,促進其下游保護基因的表達。3原花青素可能通過抑制線粒體凋亡途徑而對HEI-OC1細(xì)胞起到保護作用。
【圖文】：

結(jié) 果結(jié) 果 損傷模型的建立C1 細(xì)胞正常狀態(tài)下生長狀況 HEI-OC1 細(xì)胞是單層貼壁生長型細(xì)胞，易被消化，貼壁能力比細(xì)胞傳代 2h 后才開始貼壁，8h 時基本貼壁完全。貼壁后的細(xì)胞，形態(tài)均勻，透光性好，輪廓清晰，密度低時可呈放射狀生長，邊緣轉(zhuǎn)角處的細(xì)胞密度較高，其余細(xì)胞密度較低且分散均勻（見之間連接成片，互相依靠、緊密銜接，呈“鋪路石”狀，為較典

圖 2 HEI-OC1 細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定本課題組前期建立的 t-BHP 致 HEI-OC1 細(xì)胞氧化損傷與凋亡的細(xì)HP 終濃度分別為 50μM、100μM 與 200μM 的輕、中、重度氧化損。8 法檢測 t-BHP 對 HEI-OC1 細(xì)胞增殖活力的影響 CCK8 法檢測 t-BHP 對 HEI-OC1 細(xì)胞增殖活力的影響，結(jié)果顯示以上，隨著染毒濃度的增加，，細(xì)胞的增殖活力呈現(xiàn)明顯的降低趨勢（1）；低、中、高濃度染毒 12h，各組的細(xì)胞增殖活力分別為對照組的001），0.62 倍（P<0.001）與 0.52 倍（P<0.001），200μM 的 t-BHP使細(xì)胞增殖基本抑制（表 2，圖 3）。表 2 不同濃度的 t-BHP 處理 12h 對細(xì)胞增殖活力的影響（x±s）t-BHP（μM） Cell viability（％）
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R135.8

【參考文獻】

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本文編號：2599430