【摘要】：鎘是具有很強毒性的重金屬,常見于工業(yè)場所、食品污染物和煙草中。低濃度鎘就具有毒性,因為其在體內(nèi)的半衰期長達10～30年,易在體內(nèi)蓄積,可對包括肺臟、肝臟、’腎臟、睪丸、腦和胎盤在內(nèi)的多個器官產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p害。鎘可進入腦實質(zhì)和神經(jīng)元導(dǎo)致人和動物模型的神經(jīng)學(xué)上的改變,引起注意力低下、痛覺敏感性高、嗅覺異常和記憶力下降。些以神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞為模型的體外研究表明,μM級的鎘就具有神經(jīng)毒性,且這種細(xì)胞毒性與誘導(dǎo)凋亡有一定的相關(guān)性,并得出鎘致皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡是引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常及導(dǎo)致記憶減退、智力發(fā)育低下的主要原因,但鎘致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機制尚未闡明。本研究用孕18～19d Sprague Dawley (SD)大鼠的胎鼠建立體外培養(yǎng)的大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞模型,通過體外試驗探討了鎘對大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性損傷效應(yīng)及其凋亡可能的作用機理,為進一步認(rèn)識鎘的神經(jīng)毒性作用提供理論依據(jù)。 1、鎘誘導(dǎo)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的線粒體途徑 為從線粒體途徑研究鎘致大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機制。本研究在建立體外原代大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,以不同濃度(0、5、10、20μmol/L)醋酸鎘染毒12h,Hoechst33258熒光染色觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平和線粒體膜電位(△Ψm);實時熒光定量PCR檢鋇Caspase-3mRNA轉(zhuǎn)錄水平。以10μmol/L醋酸鎘染毒大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞0、12、24和48h,免疫印跡檢測Caspase-9活化和PARP裂解情況。結(jié)果表明：經(jīng)免疫組化染色鑒定,所培養(yǎng)的原代細(xì)胞為神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)陽性,呈現(xiàn)典型神經(jīng)細(xì)胞特征。與對照組相比,各染毒組細(xì)胞表現(xiàn)核皺縮、染色質(zhì)致密濃染、核碎裂等典型的凋亡特征,ROS水平顯著或極顯著升高(P0.05或P0.01),△Ψm顯著或極顯著降低(P0.05或P0.01),Caspase-3mRNA轉(zhuǎn)錄水平極顯著升高(P0.01),同時經(jīng)10μmol/L鎘處理皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞12h后開始檢測至Caspase-9活化及PARP裂解大片段。說明鎘誘導(dǎo)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡可能通過線粒體途徑。 2、鈣穩(wěn)態(tài)失衡在鎘致大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用 為研究鈣穩(wěn)態(tài)失衡在鎘致大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用,并探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放在鎘致神經(jīng)細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡機制中的作用。本研究用不同濃度(0、5、10、20μmol/L)醋酸鎘和細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA-AM[1,2-二(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸-四乙酰氧甲基酯,1,2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid-tetraacetoxymethyl ester (10μmol/L)]以及三磷酸肌醇受體(IP3R)特異性阻斷劑2-APB [2-氨基乙氧基二苯基硼酸鹽,2-aminoethoxydiphenyl borate (50μmol/L)]單獨或聯(lián)合作用于大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞12h。Hoechst33258熒光染色觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i,ATPase酶試劑盒測定Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性的變化,實時熒光定量PCR測定鈣調(diào)蛋白(CaM) mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明,與對照組相比,染毒后的神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)Hoechst33258染色呈現(xiàn)典型的凋亡特征,各鎘染毒組細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i極顯著升高(P0.01),Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性顯著或極顯著降低0.05或P0.01),20μmol/L組CaM mRNA轉(zhuǎn)錄水平極顯著降低(P0.01)。與相應(yīng)鎘染毒組相比,BAPTA-AM聯(lián)合組凋亡細(xì)胞減少,BAPTA-AM聯(lián)合組和2-APB聯(lián)合組細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i顯著或極顯著降低(P0.05或P0.01)。說明鎘可能通過影響CaM mRNA轉(zhuǎn)錄水平與維持鈣穩(wěn)態(tài)相關(guān)酶(Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase)的活性以及胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+庫的釋放,從而干擾神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài),而細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡在鎘誘導(dǎo)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡中起著重要作用。 3、鎘對大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞MAPK言號通路的影響 為探討不同濃度、不同時間染鎘對體外培養(yǎng)的原代大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38MAPK磷酸化的影響,大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞用不同濃度(0、5、10、20μmol/L)醋酸鎘染毒3h及10μmol/L醋酸鎘染毒不同時間(0、1、2、3、4、5、6h),免疫印跡法測定樣品ERK1/2、JNK和p38MAPK總蛋白的表達及磷酸化水平。結(jié)果表明,5、10、20μmol/L鎘處理細(xì)胞3h后,除5μmol/L鎘處理組ERK1/2磷酸化水平未升高外,其余所有濃度鎘處理組的ERK1/2、JNK1和p38MAPK磷酸化水平均升高,而染鎘后ERK1/2、JNK和p38MAPK,總量無明顯變化；10μmol/L醋酸鎘染毒后,ERK1/2磷酸化水平于2h便開始升高,一直維持到6h; JNK和p38MAPK磷酸化水平于試驗后1h開始升高,3h達到高峰,之后逐漸下降,但6h內(nèi)仍高于對照組,ERK1/2、JNK和p38MAPK、總量無明顯變化。說明鎘可引起MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白的活化。 4、鎘對大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞線粒體氧化損傷的影響 為研究鎘對大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞線粒體的氧化損傷,用不同濃度(0、5、10、20μmol/L)醋酸鎘染毒大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞6h,透射電子顯微鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化,比色法測定MDA含量,實時熒光定量PCR從轉(zhuǎn)錄水平檢測線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基COX I、COX Ⅱ COX Ⅲ表達的變化。結(jié)果表明：與對照組相比,各染毒組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化明顯,表現(xiàn)線粒體腫脹,嵴斷裂、部分或完全消失,MDA含量均極顯著升高(P0.01), COX Ⅰ、COX Ⅱ基因表達量均顯著或極顯著降低(P0.05或P0.01),10和20μmol/L染毒組COX Ⅲ基因表達量極顯著降低(P0.01)。說明鎘可引起線粒體損傷,COX Ⅰ、 COX Ⅱ、COX Ⅲ基因表達量顯著下降可能與鎘暴露導(dǎo)致的線粒體脂質(zhì)過氧化損傷有關(guān)。 5、鎘對大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2和Bax表達的影響 為研究鎘對大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax表達的影響,用不同濃度(0、5、10、20μmol/L)醋酸鎘染毒大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞12h,實時熒光定量PCR檢測Bcl-2和Bax mRNA轉(zhuǎn)錄水平,并計算Bcl-2/Bax的比值,免疫印跡檢測Bcl-2和Bax蛋白表達情況。結(jié)果表明：與對照組相比,各染毒組細(xì)胞Bax mRNA轉(zhuǎn)錄水平均極顯著升高(P0.01),而Bcl-2mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低(P0.05),Bcl-2/Bax的比值均極顯著降低(P0.01)。此外,免疫印跡的結(jié)果也顯示,隨鎘濃度的增加,Bcl-2蛋白表達水平下降,Bax蛋白表達水平升高。提示鎘能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達,從而促進細(xì)胞凋亡 6、鎘對大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞一氧化氮合酶基因mRNA轉(zhuǎn)錄的影響 為研究鎘對大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞一氧化氮合酶基因mRNA轉(zhuǎn)錄的影響,用不同濃度(0、5、10、20μmol/L)醋酸鎘染毒大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞12h,實時熒光定量PCR檢測神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS) mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明：與對照組相比,5、10μmol/L組nNOS mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著和極顯著升高(P0.05和P0.01);20μmol/L組iNOS mRNA轉(zhuǎn)錄水平極顯著升高(P0.01)。說明鎘可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)nNOS和iNOS mRNA的轉(zhuǎn)錄。
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R114

【參考文獻】

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本文編號：2594523