本文關鍵詞：環(huán)境鎘暴露人群尿液中小分子代謝產物表征差異研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《暨南大學》 2014年

環(huán)境鎘暴露人群尿液中小分子代謝產物表征差異研究

湯柳英  

【摘要】：環(huán)境鎘污染對機體健康損害研究一直是近幾十年來公共衛(wèi)生領域研究的熱點問題。資料顯示，鎘為已知的最易在體內蓄積的毒物之一，長期鎘暴露與腎臟損傷、骨骼損害、心血管疾病等存在正相關關系，鎘暴露是眾多損害的危險因素，其導致患者死亡率增加，尤以女性更甚，腎損害是鎘暴露引起的最早期關鍵效應。 在鎘的健康損害效應研究中，國際上將尿鎘作為公認的內暴露指標以反映體內鎘負荷水平，尿β2-MG、NAG等效應性生物標志物作為早期腎損傷監(jiān)測指標，被廣泛應用，是鎘中毒人群臨床診斷和治療的重要參考依據(jù)。 人們對于鎘的生理代謝過程仍知之甚少，對鎘的健康危害的機理仍有許多未明之處。本研究擬采用代謝組學法，探索環(huán)境鎘長期暴露人群尿中顯著變化的小分子代謝產物，從代謝途徑角度尋找環(huán)境鎘暴露對機體健康損害的證據(jù)，為進一步尋找環(huán)境鎘暴露健康損害相關的生物標志物提供線索。研究目的 探索環(huán)境鎘長期暴露人群尿中顯著變化的小分子代謝產物，為尋找環(huán)境鎘暴露健康損害相關的生物標志物提供線索。研究方法1.流行病學調查1.1調查對象 根據(jù)歷史資料和研究目的，選擇某環(huán)境高鎘礦區(qū)作為環(huán)境鎘暴露區(qū)，選擇無明確重金屬污染史，與暴露區(qū)經濟水平相當、居民生活條件和生活習慣相似的地區(qū)作為對照區(qū)進行現(xiàn)場調查。選擇本地居住時間15年以上，以居民家中自產大米和蔬菜為主要食物來源的45-70歲女性為調查對象，排除肝腎疾病及慢性代謝性等疾病。 1.2樣本的采集、運輸及保存大米和蔬菜的采集、運輸及保存 采集調查對象當季家中自種自食大米和葉類蔬菜各一份，統(tǒng)一編號并記錄；統(tǒng)一將收集的大米和新鮮蔬菜迅速送至實驗室，分析前儲存于-4℃冷庫。尿樣的收集、運輸及保存 收集調查對象空腹晨尿貯存于冷藏箱中，迅速送至實驗室，分裝至凍存管用于相關分析；尿鎘、肌酐、β2-MG和NAG檢測工作在樣品收集后8h內完成；進行HPLC-Q/TOF檢測的尿樣儲存于-80℃低溫冰箱中。1.3檢測指標及方法外暴露指標 以大米和蔬菜鎘含量作為外暴露指標，采用ICP-MS進行檢測。內暴露指標 以尿鎘作為內暴露指標，采用ICP-MS進行檢測。腎損傷生物標志物 以尿肌酐、NAG和β2-MG作為鎘暴露相關的腎損傷生物標志物，采用苦味酸法測定尿中肌酐含量，采用免疫比濁法檢測尿中β2-MG和NAG的含量。2.尿液代謝組學分析2.1代謝組學分析技術平臺樣本前處理 尿樣室溫下解凍后渦旋2min，移取100μL加入配置內標溶液，充分混合后離心10min，移取上清液后再次離心，將二次離心獲得的上清液上機分析。液相色譜條件 采用C18反相色譜柱，柱溫保持在50℃，一次進樣量為5μL；流動相A：純水+0.1%甲酸，B：甲醇+0.1%甲酸，流速0.4mL/min，執(zhí)行梯度洗脫程序。質譜條件 電離源：ESI，毛細管電壓：3500V，干燥氣溫度：350℃，流速：10.0L/min-1，霧化壓力：30psi，質荷比（m/z）檢測范圍：50~1000。 2.2代謝組學數(shù)據(jù)處理平臺 采用SPSS13.0進行秩和檢驗和ROC曲線繪制等；采用MPP12.1進行色譜峰的識別和前處理；運用SIMCA-P13.0進行PCA和OPLS-DA分析，篩選VIP值較大的小分子代謝產物；通過數(shù)據(jù)庫，對篩選的代謝產物進行鑒定。 3.質量控制 現(xiàn)場調查人員經過統(tǒng)一培訓，嚴格按照納入排除標準選擇調查對象；尿樣、大米和蔬菜在運輸過程中保持冷鏈；各項指標檢測均由實驗室相關專業(yè)人員承擔，測定前調試儀器穩(wěn)定性，樣品進樣順序隨機，樣品間穿插空白樣和質控樣，要求質控樣中內標物豐度及保留時間RSD小于10%。 結果 1.流行病學資料 1.1人口學資料 根據(jù)研究目的和納入排除標準，本研究以60名女性為調查對象，暴露組與對照組各30人，年齡分別為55.3±6.99歲和59.7±7.52歲。 1.2調查對象外暴露水平 分析暴露組和對照組人群食用自產大米各30份，蔬菜各30份，與對照組相比，暴露組米鎘和菜鎘含量增高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P 0.001）。 1.3調查對象內暴露水平 對照組和暴露組人群尿鎘含量中位數(shù)分別為1.95μg/g.Cr和8.33μg/g.Cr，分析發(fā)現(xiàn)，暴露組人群尿鎘含量高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P 0.001）。 1.4調查對象腎損傷相關生物標志物水平 對照組與暴露組人群尿肌酐中位數(shù)分別為84.38mg/dL和85.25mg/dL，其差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）；對照組與暴露組人群尿NAG含量中位數(shù)分別為5.50U/g.Cr和6.18U/g.Cr，其差別無統(tǒng)計學意義（P0.05）；對照組與暴露組人群尿β2-MG含量中位數(shù)分別為0.04mg/g.Cr和0.07mg/g.Cr，其差別無統(tǒng)計學意義（P0.05）。提示與對照組人群相比，本研究中環(huán)境鎘暴露組人群未見腎損害。 2.代謝組學分析 2.1檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性和精密度 正離子模式（ESI+）下，QC樣中內標物豐度值和保留時間的RSD分別為5.13%和0.06%，負離子模式（ESI-）下分別為2.00%和0.06%。提示該檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性和精密度符合代謝組學分析要求。 2.2模式識別 通過HPLC-Q/TOF檢測出兩組人群尿液中有效代謝物共2351個；經非參數(shù)檢驗，與對照組相比，暴露組人群尿液中有139個代謝物發(fā)生變化（P0.05）；將這139個代謝物用于模式識別分析，建立PCA和OPLS-DA模型，發(fā)現(xiàn)暴露組和對照組人群尿液呈現(xiàn)不同的代謝輪廓，建立的OPLS-DA模型能夠解釋兩組人群尿液中全部變異的96.7%，模型對未知樣本的判別準確率為95.3%，說明建立模型效果良好。結果表明暴露組人群尿液中存在的某些小分子代謝產物，表現(xiàn)出與對照組不同的特征。 2.3鎘暴露引起變化的代謝產物分析 采用VIP值、z值等方法篩選了9個具有顯著性差異的小分子代謝產物，它們在暴露組人群尿液中均呈現(xiàn)上調趨勢，其AUC值為0.658-0.714，表明通過觀察這些代謝產物的變化能夠較好地將環(huán)境鎘暴露組與對照組人群區(qū)分開來。它們可望作為環(huán)境鎘暴露相關的特征性代謝物提供重要線索。這9個代謝產物主要為核苷類化合物、脂類化合物和氨基酸類化合物等。 結論 1、通過HPLC-Q/TOF技術對環(huán)境鎘暴露人群尿液代謝產物進行分析，鑒定出9個有顯著變化的小分子代謝產物，，它們在暴露組人群尿液中均呈現(xiàn)上調趨勢。這9個代謝物主要與氨基酸代謝、脂類代謝、核苷酸代謝有關； 2、與經典的鎘暴露腎損傷早期生物標志物相比，代謝組學分析能夠更早的發(fā)現(xiàn)環(huán)境鎘暴露對機體作用的微觀變化和生理生化作用，本研究結果對深入探討鎘損害機制及進一步確認其作為生物標志物提供了重要線索。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R114
【目錄】：

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本文編號：259200