【摘要】：目的大量研究表明煙草煙霧能引起機體各個系統(tǒng)的疾病,而機體的疾病狀態(tài)往往與細胞線粒體的損傷有關(guān)。線粒體在介導(dǎo)細胞凋亡的過程中起著至關(guān)重要的作用,在細胞凋亡的過程中,線粒體的膜通透性的異常,能引起線粒體膜電位的降低,相關(guān)凋亡蛋白表達水平改變,細胞的氧化和抗氧化水平的失衡。研究線粒體在介導(dǎo)細胞凋亡過程中的具體機制,對于進一步研究細胞凋亡的調(diào)控機制具有重要意義。本文旨在探索煙草煙霧凝集物(cigarette smoke condensate,CSC)對永生化人支氣管上皮細胞(immortalized human bronchial epithelial,BEAS-2B)的線粒體損傷機制,為進一步研究CSC的毒作用機制以及預(yù)防煙草煙霧引發(fā)機體疾病提供科學(xué)依據(jù)。方法1.用CSC對融合至70%左右的BEAS-2B細胞進行染毒,染毒持續(xù)24小時,染毒后的BEAS-2B細胞即為實驗所用細胞。2.設(shè)立二甲基亞砜組(Dimethyl Sulfoxide,DMSO)為溶劑對照組、正常未染毒BEAS-2B組(空白對照組)、CSC染毒組,通過細胞形態(tài)學(xué)觀察、劃痕實驗、流式細胞儀、ELISA、CCK-8技術(shù)檢測各組細胞形態(tài)變化、細胞凋亡率以及功能改變。3.運用ELISA、Western blot、RT-qPCR技術(shù)檢測各組細胞的線粒體膜電位是否改變以及各組細胞凋亡相關(guān)基因、蛋白的相對表達。結(jié)果1.CSC染毒對BEAS-2B細胞形態(tài)及功能的影響CSC染毒后抑制了BEAS-2B細胞活性,且隨CSC染毒終濃度的增加,BEAS-2B細胞存活率不斷下降,呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系;與空白對照組BEAS-2B細胞相比,DMSO溶劑對照組細胞形態(tài)上沒有明顯變化;0.02mg/mLCSC染毒組細胞及胞核的形態(tài)均無明顯改變,但少數(shù)細胞內(nèi)出現(xiàn)空泡,0.04mg/mL組細胞出現(xiàn)腫脹變形,細胞核開始增大變形,核仁增大,出現(xiàn)核畸形;0.06mg/mL組開始胞膜形態(tài)開始變形,胞膜間出現(xiàn)了針刺樣突起,胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡;0.08mg/mL組細胞面積增大,細胞及胞核明顯變形,一些細胞膜出現(xiàn)輪廓變形模糊,胞膜結(jié)構(gòu)開始崩解,少量細胞出現(xiàn)核碎裂等特征;在6h、12h、24h、48h檢測點時,溶劑對照組及各CSC濃度組細胞的遷移距離差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)。DMSO組與正常BEAS-2B細胞組遷移距離的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)。2.染毒后各組細胞ROS的檢測激光共聚焦顯微鏡下觀察到隨著CSC染毒濃度的提高,細胞內(nèi)ROS熒光信號強度也隨之增強。熒光酶標儀檢測結(jié)果顯示DMSO組與各CSC染毒組整體ROS水平具有差異,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=143.390,P㩳0.05);DMSO組與0組(空白對照)組間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);各不同濃度CSC染毒組細胞間ROS水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P㩳0.05)。3.SOD活性檢測以DMSO組為對照,各組細胞整體SOD活力水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=195.680,P㩳0.05),除空白對照組外,各CSC染毒組細胞與DMSO組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P㩳0.05)。隨著CSC染毒濃度的提高,SOD活力單位逐漸降低。4.細胞凋亡率的檢測以DMSO組為對照,使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結(jié)果顯示:DMSO溶劑對照組與空白對照組比較,凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)。不同濃度CSC處理后,細胞的凋亡率上升。CSC染毒組細胞凋亡率均大于DMSO組細胞(均P0.05),且隨著CSC染毒濃度的升高,細胞凋亡率逐漸升高。5.線粒體膜電位的檢測激光共聚焦顯微鏡下觀察到隨著CSC染毒濃度的提高,細胞內(nèi)紅綠熒光比明顯下降,提示CSC染毒BEAS-2B細胞引起其線粒體膜電位下降,且膜電位下降程度隨CSC染毒濃度的升高而增強6.各組細胞Bcl-2、Bax、Cyt-C和caspase-3基因mRNA的檢測熒光定量qPCR檢測結(jié)果顯示0組(空白對照組)細胞與DMSO組間mRNA的表達量相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而其余各CSC濃度染毒組Bcl-2、Bax、Cyt-C和caspase-3基因mRNA表達量與DMSO組表達量間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);Bcl-2基因:0.02組、0.04組、0.06組、0.08組的表達量均低于DMSO組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),且隨CSC染毒濃度的提高,Bcl-2表達量逐漸降低;Bax、Cyt-C和caspase-3基因:各CSC組表達量均高于DMSO組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),隨著CSC染毒濃度的提高,Bax、Cyt-C和caspase-3基因表達量逐漸升高7.Bcl-2、Bax和活化的caspase-3蛋白表達情況的檢測Western Blot檢測細胞蛋白結(jié)果顯示:空白對照組與DMSO組的Bcl-2蛋白表達量相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而CSC染毒組的Bcl-2蛋白表達量低于DMSO組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),空白對照組的Bax和活化的caspase-3蛋白的表達量與溶劑對照組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);CSC組Bax和活化的caspase-3蛋白表達量均高于DMSO組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論CSC誘導(dǎo)BEAS-2B細胞產(chǎn)生氧化損傷,導(dǎo)致細胞活力降低、細胞形態(tài)改變以及遷移能力改變,引起細胞內(nèi)氧化與抗氧化水平的失衡,線粒體在氧化應(yīng)激狀態(tài)下膜通透性增強,導(dǎo)致Bax表達上調(diào)、Bcl-2表達下調(diào),引起細胞色素C的釋放和caspase-3激活,最終引起線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑的惡性循環(huán)。
【圖文】：

圖 3.1.1 CSC 對 BEAS-2B 細胞存活率的影響1.2 細胞的形態(tài)學(xué)改變將各組細胞由培養(yǎng)箱中取出，置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，DMSO對照組細胞與空白對照組 BEAS-2B 細胞相比，，細胞及胞核的形態(tài)沒有明顯；0.02mg/mLCSC 染毒組細胞及胞核的形態(tài)與 DMSO 組無明顯差異，但少胞內(nèi)出現(xiàn)空泡；0.04mg/mLCSC 組細胞開始出現(xiàn)腫脹，部分細胞核已經(jīng)變現(xiàn)了核增大、核畸形；0.06mg/mLCSC 組開始胞膜形態(tài)開始變形，胞膜間出針刺樣突起，胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡；0.08mg/mLCSC 組細胞結(jié)構(gòu)開始崩解，細及細胞核廓模糊，胞核出現(xiàn)畸變，部分胞核碎裂，細胞面積明顯增大等形改變。見圖 3.1.2。

2細胞形態(tài)觀察
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R114

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本文編號：2583008