【摘要】：研究背景 鐵是人體含量最多的一種必需微量元素。長期以來，對鐵代謝的研究主要集中在鐵缺乏/缺鐵性貧血的防治。隨著人們對鐵代謝認識的發(fā)展，如今已經(jīng)從鐵缺乏擴展到機內(nèi)鐵過負荷的原因以及鐵代謝紊亂引發(fā)的一系列相關(guān)疾病的機制探討，尤其是鐵過量與代謝性疾病之間的關(guān)系。 近年來，諸多流行病學調(diào)查已經(jīng)明確糖尿病，非酒精性脂肪肝等代謝性疾病患者存在鐵過負荷。前瞻性研究進一步發(fā)現(xiàn)體內(nèi)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白的升高與代謝綜合征的發(fā)病率成正相關(guān)。多項META分析得出結(jié)論：機體鐵含量過高是引起糖脂代謝紊亂、心血管疾病等發(fā)病的誘因之一，但具體機制尚未明確。血脂代謝的紊亂是代謝綜合征的主要癥狀之一，血脂參數(shù)的持續(xù)異常顯著增加心血管疾病的發(fā)病風險。流行病學調(diào)查顯示鐵過負荷人群常常伴有高脂血癥，LDL-C、HDL-C等脂蛋白水平改變；動物給予單純的高鐵膳食也可見到血脂參數(shù)的異常。由于肝臟是調(diào)節(jié)脂代謝的重要器官，鐵沉積于肝臟引起的氧化應(yīng)激損傷是導致脂代謝紊亂的一個原因。事實上，機體鐵沉積不僅僅發(fā)生在肝臟，脂肪、腦、胰腺等均有鐵沉積的存在。 與肝臟同樣，脂肪組織是維持脂代謝平衡的重要器官。近年來，有研究證實脂肪組織是一個敏感的鐵感應(yīng)器官，它可以表達所有與鐵代謝相關(guān)的調(diào)控、儲存及轉(zhuǎn)運的因子如鐵蛋白、鐵調(diào)節(jié)蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、HEF、hepcidin、ferroportin等。目前，脂肪組織不再是一個單純的儲脂產(chǎn)能組織，其分泌的細胞因子如瘦素、脂聯(lián)素等對于維持機體能量和糖脂代謝的平衡具有重要的調(diào)節(jié)作用。是否脂肪組織像肝臟一樣，會因為鐵過負荷影響其內(nèi)分泌功能，成為鐵過量引起脂代謝紊亂的機制之一，這方面研究一直沒見報道是個值得探索的問題。 因此，本實驗通過給小鼠腹腔注射右旋糖酐鐵，觀察血脂代謝指標的變化，并且用高通量細胞因子芯片觀察血液中與脂代謝相關(guān)細胞因子的變化特點；進一步細胞實驗證明不同濃度的結(jié)合型和離子型的鐵干預(yù)能否直接影響脂肪細胞因子的分泌；最后在鐵過負荷動物造模的同時，補充與血脂代謝最為密切的細胞因子脂聯(lián)素至正常水平，檢測脂聯(lián)素作用的酶類活性及血脂參數(shù)的恢復情況，明確脂聯(lián)素異常是否為鐵過載引起的血脂異常的機制之一。 研究目的 觀察鐵過負荷小鼠血脂代謝變化以及與脂代謝密切相關(guān)的多個細胞因子的變化特點；觀察鐵過負荷對脂肪細胞細胞因子分泌的直接影響并證實其分泌的異常是否為鐵過負荷引起血脂代謝異常的機制之一。為闡明鐵過負荷引起的代謝紊亂的原因機制提供證據(jù)支持，同時也為鐵過負荷引起的血脂代謝紊亂的預(yù)防和治療方法提供一定新的思路。 研究方法 1.鐵過負荷對小鼠血脂代謝的影響 1.1實驗動物小鼠鐵過負荷模型的建立 雄性C57小鼠（購自上海斯萊克公司），體重(20士2)g。按體重隨機分為空白對照組、鐵過負荷實驗組，每組10只。實驗組右旋糖酐鐵腹腔注射2mg/d，對照組注射生理鹽水，右旋糖酐鐵注射總量為12mg。于第7天檢測血清鐵、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度、總鐵結(jié)合力等血清鐵相關(guān)參數(shù)；原子吸收法檢測肝臟、脂肪鐵含量；脂肪組織普魯士藍染色。 1.2鐵過負荷小鼠血脂參數(shù)及其他生化指標測定 檢測血糖、TG、TC、LDL-C、HDL-C、ALT、AST等血清生化指標。血糖儀檢測小鼠血糖水平。放射免疫法檢測小鼠血液胰島素水平。 1.3肝臟甘油三酯合成酶類活性測定 實時定量熒光PCR法檢測小鼠肝臟FAS、ACC等甘油三酯合成酶mRNA水平；Western blot檢測ACC酶磷酸化水平。 2.鐵過負荷小鼠血清各類細胞因子含量及脂肪組織細胞因子mRNA的變化 2.1高通量細胞因子芯片檢測血清細胞因子的改變 選取IL-1β，IL-2，IL-6，IL-10，IL-15，IL-12(p70)，TNF-α，IFNγ，GLP-1，GIP、Leptin，Resistin，Ghrelin，PAI-1，MCP-1，RANTES，VEGF-basic、FGF-bb、PDGF等19個細胞因子定制細胞因子芯片，檢測血清含量變化。 2.2Elisa重復驗證芯片結(jié)果 2.3檢測脂肪組織中細胞因子的mRNA表達水平 采用實時定量熒光PCR法測定小鼠血清中顯著改變的細胞因子脂肪組織中的mRNA表達變化。 3.不同濃度的結(jié)合型和游離型鐵對脂肪細胞瘦素、脂聯(lián)素分泌的影響 3.13T3-L1細胞培養(yǎng)分化 選用3T3-L1前脂肪細胞，DMEM培養(yǎng)液中加入10%小牛血清、雙抗，培養(yǎng)箱生長。細胞接觸抑制至融合后用DMEM+10%胎牛血清培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入胰島素（10μg/ml）、地塞米松(1μM)、IBMX(0.5mM)分化液分化，3天后換液，完全培養(yǎng)液并加入胰島素（10μg/ml）干預(yù)，每隔兩天換液一次，直至8-12天分化為成熟脂肪細胞，油紅O染色鑒定。 3.2不同濃度的結(jié)合型鐵和游離鐵干預(yù)后細胞活性檢測 用MTT法檢測不同濃度的結(jié)合型鐵和游離鐵干預(yù)后細胞活性情況。 3.3不同飽和度的轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合型鐵對脂肪細胞瘦素、脂聯(lián)素分泌影響 用不同比例的apo-transferrin/holo-transferrin配成轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度為0、25%、50%、75%、100%5個濃度梯度的混合液，干預(yù)成熟脂肪細胞24h，轉(zhuǎn)鐵蛋白總濃度為30μM，Elisa法檢測細胞培養(yǎng)液中瘦素、脂聯(lián)素含量，實時定量熒光PCR法測定mRNA的表達水平。 3.4不同濃度的細胞外游離FeSO_4對脂肪細胞瘦素、脂聯(lián)素分泌的影響 用0μM，10μM，100μM，1000μM游離FeSO_4干預(yù)脂肪細胞24h，檢測瘦素、脂聯(lián)素mRNA水平及細胞培養(yǎng)液中的含量。 4.外源性脂聯(lián)素補充對鐵過負荷小鼠血脂代謝及相關(guān)酶活性的影響 4.1血清脂聯(lián)素含量恢復后觀察血液脂代謝變化 小鼠右旋糖酐鐵注射同時，腹腔注射重組脂聯(lián)素，濃度為3μg/g，使其血液中含量恢復正常，檢測小鼠血清中TG、LDL-C、HDL-C等血脂代謝指標變化。放射免疫法檢測胰島素水平變化。 4.2甘油三酯分解酶活性的變化 血清中脂聯(lián)素水平恢復至正常后，比色法檢測各組小鼠血清脂蛋白酯酶、肝酯酶活性變化。 5.數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與處理 采用quantity one圖像分析系統(tǒng)對western條帶進行灰度分析，實驗數(shù)據(jù)用(X±S)表示。應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析，兩組間差異采用成組設(shè)計資料的t檢驗，多組間差異采用單因素方差分析。各組方差齊時，對照組與各實驗組間比較采用Dunnett法，各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗和SNK-q檢驗；方差不齊時采用Dunnett’s C檢驗。p0.05為差別有統(tǒng)計學意義，p 0.01為非常顯著性水平。 結(jié)果 1.鐵過負荷對小鼠血脂的影響 1.1鐵過負荷小鼠機體鐵狀況 與對照組相比，右旋糖酐鐵注射小鼠血清鐵、轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度（TS%）、總鐵結(jié)合力（TIBC）均顯著升高（p0.01）；模型組小鼠肝臟鐵水平較對照組升高4倍，脂肪組織鐵含量升高5倍（p0.01），通過普魯士藍染色進一步確定脂肪組織存在明顯的鐵沉積。 1.2鐵過負荷小鼠血清生化指標變化 與對照組相比，鐵過負荷模型小鼠血清甘油三酯水平（TG）顯著升高（p0.05）；低密度脂蛋白膽固醇酯（LDL-C）顯著升高（p0.01），高密度脂蛋白膽固醇酯（HDL-C）顯著降低（p0.01）；血糖、膽固醇（TC）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）沒有明顯改變，實驗組、對照血清胰島素水平差別沒有統(tǒng)計學意義（p0.05）。 1.3鐵過負荷小鼠肝臟甘油三酯合成相關(guān)酶ACC、FAS變化 實驗組肝臟ACC、FAS mRNA水平與對照組沒有統(tǒng)計學差異（p0.05），ACC的磷酸化水平?jīng)]有明顯變化。 2.鐵過負荷小鼠血清各類細胞因子含量及脂肪組織細胞因子mRNA變化 2.1細胞因子芯片結(jié)果 從芯片結(jié)果來看，IL-1β，IL-2，IL-6，IL-10，IL-15，IL-12(p70)，TNF-α，IFN-γ等炎性細胞因子含量與對照組沒有統(tǒng)計學差異；GIP、GLP-1兩個促胰島素分泌細胞因子沒有顯著改變；生長因子和趨化因子中，實驗組趨化因子RANTES顯著升高（p0.01），VEGF， FGF、PDGF、MCP-1等與對照組差別均沒有統(tǒng)計學意義；由脂肪細胞分泌的細胞因子瘦素、抵抗素、脂聯(lián)素出現(xiàn)顯著的降低（p0.01），PAI-1有降低趨勢，但沒有統(tǒng)計意義（p=0.27），胃底細胞分泌的Ghrelin與對照組相比顯著升高（p0.01）。 2.2Elisa重復驗證結(jié)果 實驗組小鼠血清中，由脂肪細胞分泌的脂聯(lián)素、瘦素出現(xiàn)了顯著地降低（p0.01），與芯片結(jié)果一致。 2.3脂肪組織細胞因子的mRNA水平變化 實驗組小鼠脂肪組織中，脂聯(lián)素、瘦素的mRNA水平降低顯著（p0.01）。 3.不同濃度的結(jié)合型鐵和離子型鐵干預(yù)對脂肪細胞細胞因子分泌的影響 3.13T3-L1前脂肪細胞分化結(jié)果 用完全培養(yǎng)液加入分化液分化三天，再用完全培養(yǎng)液加胰島素干預(yù)約十天后，細胞由梭形變圓，核周圍脂滴聚集，呈“戒環(huán)樣”，經(jīng)油紅O染色鑒定前脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞，成熟脂滴形成。 3.2不同濃度的離子型和結(jié)合型鐵干預(yù)后細胞活性情況 用MTT法檢測后發(fā)現(xiàn)，最高濃度30μM的holo-transferrin和1000μM的硫酸亞鐵干預(yù)后，細胞活性與對照組沒有明顯差異（p0.05）。 3.3不同飽和度的轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合型鐵對脂肪細胞因子分泌的影響 轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度在大于等于50%，脂肪細胞TfR-1mRNA水平出現(xiàn)降低（p0.05），提示細胞內(nèi)的鐵含量升高；細胞中的瘦素、脂聯(lián)素mRNA水平隨轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度升高，逐漸降低（p0.05）；轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度達到75%時，細胞培養(yǎng)液中瘦素、脂聯(lián)素含量顯著降低（p0.05）。 3.4不同濃度的細胞外游離FeSO_4干預(yù)影響脂肪細胞因子分泌 FeSO_4干預(yù)成熟脂肪細胞后，濃度在10μM時，細胞TfR-1mRNA水平就出現(xiàn)了顯著降低（p0.05），細胞中瘦素、脂聯(lián)素的mRNA水平隨著游離鐵濃度的升高，逐漸降低（p0.05）。100μM濃度的FeSO_4干預(yù)后，細胞培養(yǎng)液中瘦素、脂聯(lián)素含量降低（p0.05）。 4．外源性補充重組脂聯(lián)素對鐵過負荷小鼠血脂代謝的影響 4.1鐵過負荷小鼠補充重組脂聯(lián)素至正常后血脂代謝參數(shù)變化 外源性補充重組脂聯(lián)素至正常水平后，可見血清TG的升高得到有效緩解，差別有統(tǒng)計學意義（p0.05），HDL-C有升高趨勢，LDL-C也有一定程度的恢復，但與對照組相比仍有統(tǒng)計學差異。 4.2鐵過負荷小鼠補充重組脂聯(lián)素后血清LPL、HL酶活性變化 鐵過負荷小鼠血清中分解甘油三酯的脂蛋白酯酶和肝酯酶活性降低（p0.05）；重組脂聯(lián)素水平恢復正常后，脂蛋白酯酶活性較模型組顯著升高（p0.05），肝酯酶活性與實驗組差別沒有統(tǒng)計學意義。 結(jié)論 1.鐵過負荷可引起血清甘油三酯、低密度脂蛋白升高，高密度脂蛋白降低；但對肝臟中與甘油三酯合成相關(guān)酶類沒有受到影響； 2.鐵過負荷小鼠血液中與脂代謝密切相關(guān)的脂肪細胞因子瘦素、脂聯(lián)素的含量降低，而炎性因子、趨化因子、生長因子等其他細胞因子沒有變化，提示細胞因子含量的異常有可能為血脂代謝紊亂原因之一； 3.細胞內(nèi)鐵含量升高后影響脂肪細胞瘦素、脂聯(lián)素的分泌，結(jié)合整體動物脂肪組織細胞因子mRNA的結(jié)果，，認為鐵過負荷在轉(zhuǎn)錄水平影響了脂聯(lián)素、瘦素的表達； 4.外源性補充重組脂聯(lián)素使血液中含量恢復至正常后，鐵過負荷小鼠血清TG水平得到一定程度緩解，說明脂聯(lián)素異常為鐵過負荷導致的機體血脂代謝紊亂的機制之一；與此同時，調(diào)控血清甘油三酯分解代謝的脂蛋白酯酶活性得到一定程度的恢復；推測脂聯(lián)素可能通過影響脂蛋白酯酶的活性參與了鐵過載引起的血液中甘油三酯的升高。
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R151.2

【共引文獻】

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3 田

本文編號：2582916