【摘要】：在全球化背景下,由食源性致病菌引起的疾病呈現(xiàn)高發(fā)態(tài)勢,嚴(yán)重威脅人們的健康,阻礙社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,成為全球共同關(guān)注的問題。食品在生產(chǎn)加工、運(yùn)輸貯存以及銷售等各個環(huán)節(jié)都可能受到細(xì)菌的污染,而且食品工業(yè)門類多、產(chǎn)量大、流通廣,所以需要快速有效、成本友好、設(shè)計簡單的細(xì)菌檢測手段來確保食品過程的安全。隨著核酸研究的不斷發(fā)展,具有特異性識別能力的功能核酸,尤其是核酸適配體和分子信標(biāo),因其方便合成、易于修飾、穩(wěn)定性好、特異性高等特點(diǎn)在食品安全領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。本論文分別基于核酸適配體對菌細(xì)胞表面特殊位點(diǎn)的識別和分子信標(biāo)對細(xì)菌特異性核酸的識別構(gòu)建了兩種不同的食源性致病菌快速檢測方法。(1)以36XC學(xué)生顯微鏡為基礎(chǔ),自制套筒式連接器安裝暗場聚光鏡,自制高度調(diào)節(jié)指針指示焦點(diǎn)高度,將36XC顯微鏡改造成便攜式暗場顯微鏡作為檢測設(shè)備。采用檸檬酸三鈉還原法合成粒徑60 nm的金納米顆粒,并用紫外可見光譜儀和透射電子顯微鏡表征。將修飾核酸適配體的金納米顆粒作為識別目標(biāo)和報告信號的功能化散射探針。使用透射電子顯微鏡表征散射探針對目標(biāo)的結(jié)合能力,發(fā)現(xiàn)細(xì)菌表面的完整性是細(xì)菌能和適配體結(jié)合的必要條件,證明功能化金納米顆粒散射探針檢測的是金黃色葡萄球菌活菌。暗場鏡檢采用10倍物鏡,分為直接暗場鏡檢和間接暗場鏡檢。直接暗場鏡檢通過觀察聚集在目標(biāo)表面的散射探針發(fā)出的葡萄串狀分布散射光點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)對金黃色葡萄球菌的可視化識別;間接暗場鏡檢的第一步是過濾洗去未結(jié)合的功能化金納米探針,再將細(xì)菌表面結(jié)合的散射探針洗脫分離并對分離出的金納米顆粒進(jìn)行暗場鏡檢,通過多步特異性分離的方法檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)物的存在。對不同濃度的金黃色葡萄球菌分別采取間接暗場鏡檢法進(jìn)行定性的檢測分析,結(jié)果顯示對金黃色葡萄球菌的陽性判定檢測限為4.6×10~6CFU/m L。通過將分離步驟中使用的水系針式過濾器替換為核酸純化柱,優(yōu)化了過濾洗滌和洗脫的操作,將方法的檢測限降低為2.9×10~3 CFU/m L,實(shí)現(xiàn)三個數(shù)量級的靈敏度改進(jìn),而且通過簡單的前處理即可實(shí)現(xiàn)實(shí)際牛奶樣品中金黃色葡萄球菌的檢測。(2)基于循環(huán)鏈置換聚合酶反應(yīng)(CSDPR)原理,以金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、腸出血性大腸埃希氏菌(EHEC)和志賀氏菌為目標(biāo)細(xì)菌,選取目標(biāo)細(xì)菌特異性的基因區(qū)間設(shè)計分子信標(biāo)熒光探針和循環(huán)引物,建立CSDPR反應(yīng)體系。通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定分子信標(biāo)熒光探針莖結(jié)構(gòu)的最佳長度為8 nt;探針和引物的最佳濃度均為200 nmol/L。針對以上四種目標(biāo)菌,以非致病性大腸埃希氏菌、表皮葡萄球菌、白色葡萄球菌等額外六種細(xì)菌為對照菌,探究CSDPR檢測方法下探針的特異性,結(jié)果顯示金黃色葡萄球菌探針能夠精確鑒定到相應(yīng)的菌種(species),EHEC探針能夠特異性鑒定EHEC,沙門氏菌和志賀氏菌探針則能鑒定到相應(yīng)的菌屬(genus)。以各稀釋梯度的四種目標(biāo)菌基因組DNA為模板,進(jìn)行CSDPR擴(kuò)增反應(yīng),建立定量CSDPR模型,實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)細(xì)菌的定量檢測。其中,對金黃色葡萄球菌的定量分析線性范圍為2×10~5~2.5×10~6 CFU/m L,檢測限為9.5×10~4 CFU/m L;對沙門氏菌、EHEC、志賀氏菌的定量分析線性范圍為1.0×10~4~1.0×10~6 CFU/m L,檢測限分別為4.8×10~4 CFU/m L、3.4×10~4 CFU/m L、3.0×10~4CFU/m L。以金黃色葡萄球菌為目標(biāo)菌,人工添加低濃度(9.2×10~1 CFU/m L、9.2×10~2CFU/m L、9.2×10~3 CFU/m L)的金黃色葡萄球菌至牛排、牛奶樣品中進(jìn)行增菌培養(yǎng),分別于4 h、6 h、8 h、10 h、12 h五個時間點(diǎn)對菌液進(jìn)行平板計數(shù)和定量CSDPR檢測,并比較平板計數(shù)和定量分析的結(jié)果。結(jié)果顯示通過最短6 h的增菌培養(yǎng)即可檢出國標(biāo)限量濃度下的金黃色葡萄球菌;在牛排樣品和牛奶樣品中金黃色葡萄球菌的平板計數(shù)結(jié)果和CSDPR定量檢測結(jié)果的平均相對誤差分別為14.5%和11.4%。
【圖文】：

第二章 適配體功能化金納米散射探針檢測金黃色葡萄球菌光鏡相連后，通過接件外側(cè)自鎖性較好的三角形螺紋同螺帽式接件連接。因?yàn)槁菝笔浇蛹隙司哂泻洼d物臺中央螺旋接口吻合的三角螺紋，所以套筒式連接器可以整體連接在載物臺下。通過轉(zhuǎn)動螺栓式接件，可以調(diào)整暗場聚光鏡的高度，使其與載物臺上表面吻合，也可以輔助調(diào)節(jié)焦點(diǎn)高度。改裝后的暗場顯微鏡，既可以直接用肉眼通過目鏡觀察，也可以使用 CCD 接口連接的相機(jī)進(jìn)行觀察和拍攝。為了便于在樣品觀察時進(jìn)行快速聚焦調(diào)節(jié)，，在圖 2-1（c）和（d）中圈出的位置標(biāo)上記號，用一片通過強(qiáng)力膠粘在載物臺邊緣的載玻片作為高度指針。在使用 10 倍物鏡觀察時，調(diào)節(jié)粗準(zhǔn)焦螺旋至高度指針上表面與圓圈處標(biāo)記持平，此時目鏡中觀察到的即為載玻片的上表面（蓋玻片的下表面）處的待觀測物，繼續(xù)調(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋即可看清樣品。這個微小的設(shè)計可以有效縮短焦距調(diào)節(jié)時間，也可以避免錯誤對焦（比如焦點(diǎn)對準(zhǔn)的是載玻片下表面）引起的錯誤觀察。

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文納米顆粒的表征外可見吸收光譜對前面合成的金納米顆粒進(jìn)行表征后得到如圖 2-2（a）所光譜中有一個單一吸收峰出現(xiàn)在 532 nm 附近，峰寬較窄，證明金納米顆徑大小較為接近，可以作為良好載體進(jìn)行核酸適配體修飾。根據(jù) Haiss 等米粒徑與紫外可見吸收峰的關(guān)系可以得出當(dāng)峰值在 532 nm 時，其粒徑大。圖 2-2（b）是金納米顆粒的透射電鏡圖，由圖可知，金納米顆粒的粒徑分散性較好，粒徑分布較為均一，符合預(yù)期，也與紫外可見吸收光譜圖的
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R155.3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 周楊;萬強(qiáng);蔡芷荷;盧勉飛;吳清平;李健順;;基于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)的大腸桿菌O157:H7快速檢測試劑盒的評價[J];微生物學(xué)通報;2017年08期

2 倪世友;王樹坤;;全球傷寒和副傷寒的流行強(qiáng)度區(qū)域及其預(yù)防策略[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2016年11期

3 劉軍;;食源性致病菌定量檢測技術(shù)研究近況[J];中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2016年02期

4 歐紅玲;陳鳳華;王巖;張巧云;賈連玲;李雪麗;孫建華;王欣茹;;快速檢測金黃色葡萄球菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法的建立與評價[J];檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床;2015年20期

5 邵碧英;董建;陳彬;陳文炳;黃曉蓉;鄭晶;繆婷玉;彭娟;;沙門氏菌核酸檢測試劑盒的評價[J];食品科學(xué);2015年24期

6 章鋼剛;賴衛(wèi)華;;食源性致病菌免疫學(xué)檢測方法研究進(jìn)展[J];食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報;2015年09期

7 宋麗萍;姜潔;李瑋;陶慶會;郭淼;路勇;;食源性致病菌快速檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J];食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報;2015年09期

8 邱亞群;扈慶華;石曉路;李迎慧;林一曼;江敏;;改良分子信標(biāo)-實(shí)時PCR快速檢測4種食源性致病菌[J];實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué);2015年08期

9 向紅;周藜;廖春;陳剛;;金黃色葡萄球菌及其引起的食物中毒的研究進(jìn)展[J];中國食品衛(wèi)生雜志;2015年02期

10 劉細(xì)霞;涂俊銘;;免疫磁珠分離技術(shù)及其在食源性致病菌檢測中應(yīng)用的進(jìn)展[J];中國抗生素雜志;2014年12期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 胡蓉;基于功能核酸的納米組裝與生物傳感的新方法研究[D];湖南大學(xué);2014年

2 段諾;食源性致病菌適配體的篩選及分析應(yīng)用研究[D];江南大學(xué);2013年

3 熊斌;金屬納米粒子在生物成像與生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用[D];湖南大學(xué);2013年

4 郭秋平;熒光信號放大檢測技術(shù)在生物大分子檢測中的研究和應(yīng)用[D];湖南大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前5條

1 李佳桐;沙門氏菌LAMP檢測方法的建立[D];延邊大學(xué);2014年

2 戴定貴;以功能化金納米顆粒為探針的暗場成像技術(shù)在重金屬檢測中的應(yīng)用研究[D];湖南大學(xué);2014年

3 常志力;我國志賀菌的流行分布與基因組進(jìn)化[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

4 楊旭;莖環(huán)結(jié)構(gòu)探針的設(shè)計及其檢測致病菌的研究[D];湖南師范大學(xué);2007年

5 姜延龍;原料乳中金黃色葡萄球菌的分離及PCR檢測[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

本文編號：2575687