【摘要】：[背景] 多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)來源廣泛,主要是由于有機(jī)物的不完全燃燒所致,如垃圾焚燒、汽車尾氣、熏制食品等,是一類重要的環(huán)境和食品污染物。多環(huán)芳烴能夠引起人體發(fā)生炎癥反應(yīng)、免疫系統(tǒng)功能下降、動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥等,嚴(yán)重地威脅著人類的健康。作為最具代表性的多環(huán)芳烴,苯并芘(benzo(a)pyrene, BaP)具有很強(qiáng)的致癌毒性,常被作為研究多環(huán)芳烴致癌的模式藥物。它的致癌機(jī)制主要被認(rèn)為是其活化代謝產(chǎn)物(BPDE)與DNA共價(jià)結(jié)合形成DNA加合物[5]。一旦DNA的損傷得不到及時(shí)的修復(fù)時(shí),就會(huì)在復(fù)制過程中造成基因突變或染色體畸變,最終促發(fā)癌癥的產(chǎn)生。目前,有大量的研究深入探討B(tài)aP誘導(dǎo)DNA損傷應(yīng)答的機(jī)制,并證實(shí)了許多與DNA損傷應(yīng)答相關(guān)的蛋白,為更好地了解BaP致癌的機(jī)理提供了重要的依據(jù)。 然而,這些研究大都集中于全細(xì)胞蛋白組學(xué)的研究,這往往會(huì)導(dǎo)致一些低豐度的蛋白被忽視,如一些細(xì)胞核內(nèi)的蛋白,它們?cè)谡{(diào)控致畸、致癌等細(xì)胞程序上起到極為重要的作用。因此,使用亞細(xì)胞分離法或細(xì)胞器官蛋白組學(xué)的方法來分析蛋白(含低豐度蛋白)表達(dá)的改變就顯得尤為重要。另一方面,考慮到DNA損傷應(yīng)答起始于細(xì)胞核內(nèi),會(huì)引起大量的核蛋白表達(dá)發(fā)生改變,因而,在本次研究中我們主要觀察不同濃度的BaP誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞后,其核蛋白改變的情況。 [目的] 為了更深入的了解BaP誘導(dǎo)的DNA損傷應(yīng)答,發(fā)現(xiàn)可能的新機(jī)制,我們采用高通量技術(shù)(雙向電泳、質(zhì)譜)全面了解BaP對(duì)HeLa細(xì)胞核蛋白表達(dá)的影響,鑒定并驗(yàn)證BaP調(diào)控的相關(guān)蛋白,從而更深入的了解BaP誘導(dǎo)DNA損傷應(yīng)答的過程,為DNA損傷應(yīng)答及BaP誘導(dǎo)的癌癥機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。 [方法] 1.不同濃度(0.1μM、1μM、10μM)的BaP處理HeLa細(xì)胞6h后,提取細(xì)胞核蛋白,并用Bradford法進(jìn)行蛋白定量 2.雙向電泳及質(zhì)譜鑒定 3.對(duì)成功鑒定的蛋白進(jìn)行查庫(Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫),并按功能對(duì)其進(jìn)行分類 4.采用siRNA干擾、Western Blot等技術(shù)對(duì)部分鑒定的蛋白的功能進(jìn)行驗(yàn)證 [結(jié)果] 1、不同濃度的BaP處理HeLa細(xì)胞后,通過對(duì)比雙向電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組中125個(gè)蛋白點(diǎn)有明顯差異(79個(gè)點(diǎn)下調(diào),46個(gè)點(diǎn)上調(diào))。最終經(jīng)質(zhì)譜成功鑒定出39個(gè)蛋白。Western blot驗(yàn)證部分蛋白(ANXA1和NF-κB),其結(jié)果與雙向結(jié)果一致。 2、采用siRNA干擾技術(shù)將ANXA1蛋白表達(dá)干擾后,BaP誘導(dǎo)的DNA損傷明顯增加(γH2AX焦點(diǎn)明顯增多)；但對(duì)細(xì)胞凋亡的影響不大。 3、P28GANK表達(dá)的下降引起NF-κB在細(xì)胞核中的表達(dá)增加,同時(shí)在胞漿中的量減少。 [結(jié)論] 1.BaP處理可導(dǎo)致細(xì)胞核蛋白的表達(dá)的改變。 2. ANXA1可降低BaP誘導(dǎo)的DNA損傷程度,起到保護(hù)的作用。 3. NF-κB通路可能參與BaP誘導(dǎo)DNA損傷應(yīng)答。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R114

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本文編號(hào)：2571668