【摘要】：鉛是最常見的環(huán)境重金屬污染物之一,嚴(yán)重威脅著人類的生存和健康。鉛具有明顯的雄性生殖毒性,能夠?qū)е滦坌跃訑?shù)量的減少,精子活性的降低。目前認(rèn)為鉛能夠產(chǎn)生雄性生殖毒性的根本原因之一是：鉛能夠在睪丸細(xì)胞中蓄積從而持續(xù)地對(duì)睪丸造成損傷。因此,闡明鉛從睪丸細(xì)胞中排出的機(jī)制,減少睪丸細(xì)胞中鉛的蓄積,促進(jìn)鉛的排出,將有利于防治鉛的雄性生殖毒性。多重耐藥相關(guān)蛋白1(Multidrug resistance associated protein 1, MRP1)最早被發(fā)現(xiàn)是由于其能夠?qū)⑦M(jìn)入癌細(xì)胞中的抗癌藥物排出,進(jìn)而使癌癥患者產(chǎn)生耐藥性。MRP1在機(jī)體組織中廣泛表達(dá),尤其在肺、血.腦屏障、腎臟和睪丸中。近些年發(fā)現(xiàn),MRP1不但能夠轉(zhuǎn)運(yùn)抗癌藥物還能夠轉(zhuǎn)運(yùn)一些重金屬,如汞,鎘等。但MRP1與鉛轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)系尚不明確。之前的一些研究認(rèn)為MRP1轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬的過程可能涉及還原型谷胱甘肽(Glutathione, GSH)。但是目前GSH參與MRP1轉(zhuǎn)運(yùn)的具體機(jī)制尚不清楚。睪丸支持細(xì)胞是睪丸中的重要組成細(xì)胞。睪丸支持細(xì)胞之間能夠形成血-睪屏障結(jié)構(gòu),同時(shí)它能夠?yàn)檩斁苤芯拥纳商峁┐x和結(jié)構(gòu)的支持。因此睪丸支持細(xì)胞在生殖中起著重要的作用。本研究通過同源建模、分子虛擬篩選、慢病毒轉(zhuǎn)染RNAi構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株等一系列方法探討MRP1和GSH在睪丸支持細(xì)胞鉛蓄積和外排中的作用及機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn),睪丸支持細(xì)胞中鉛的蓄積和排出機(jī)制與MRP1和GSH有關(guān)。該研究將有助于預(yù)防和治療重金屬鉛對(duì)睪丸的損傷,進(jìn)而推動(dòng)我國(guó)公共衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展。目的：(1)通過構(gòu)建小鼠MRP1的三維蛋白結(jié)構(gòu)模型和分子虛擬篩選,查找出與MRP1結(jié)合能力較強(qiáng)的生物小分子,并判斷GSH與MRP1結(jié)合能力。(2)研究鉛對(duì)小鼠睪丸支持細(xì)胞株(TM4細(xì)胞)MRP1的表達(dá)及轉(zhuǎn)運(yùn)活性的影響,初步探討TM4細(xì)胞中鉛與MRP1之間的關(guān)系。(3)通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建MRP1穩(wěn)定低表達(dá)的TM4細(xì)胞,為探討MRP1在TM4細(xì)胞鉛轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用提供技術(shù)支持。(4)探討MRP1和GSH在TM4細(xì)胞鉛排出和蓄積中的作用,為有效地預(yù)防重金屬鉛的雄性生殖毒性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：(1)小鼠MRP1蛋白的同源建模和分子對(duì)接通過在線服務(wù)器TMpred和ID Protein Structure Prediction Server分別對(duì)小鼠的MRP1的蛋白跨膜區(qū)域以及蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。同時(shí),利用SYBYL軟件進(jìn)行同源建模和分子對(duì)接。通過搜索模板、同源識(shí)別、序列比對(duì)、構(gòu)建模型保守區(qū)域、構(gòu)建可變循環(huán)區(qū)域、添加側(cè)鏈及優(yōu)化模型一系列步驟對(duì)小鼠MRP1的蛋白三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行構(gòu)建。通過SYBYL軟件以及ProSA網(wǎng)站對(duì)構(gòu)建的MRP1結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過SYBYL軟件計(jì)算并搜索MRP1三維結(jié)構(gòu)中可能的小分子結(jié)合區(qū)域(口袋結(jié)構(gòu))。最后基于分子對(duì)接的方法,對(duì)ZINC庫(kù)中180313種化合物進(jìn)行虛擬篩選,列出與MRP1蛋白結(jié)合能力較強(qiáng)的化合物,并判斷GSH與MRP1結(jié)合能力。(2)細(xì)胞存活率檢測(cè)以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種TM4細(xì)胞于96孔板中,在培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的醋酸鉛和各種抑制劑(MK571、BSO、EA、NaN3)培養(yǎng)24h,用CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的存活率。由此篩選本研究中所用醋酸鉛以及各種抑制劑的處理濃度。(3) MRP1轉(zhuǎn)運(yùn)活性檢測(cè)分別在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的MRP1活性特異性抑制劑MK571和鉛,用酶標(biāo)儀測(cè)定MRP1的轉(zhuǎn)運(yùn)底物Calcein和SNARF-1的熒光強(qiáng)度,以觀察TM4細(xì)胞中MRP1轉(zhuǎn)運(yùn)活性。(4)檢測(cè)鉛對(duì)小鼠TM4細(xì)胞MRP1表達(dá)水平的影響體外培養(yǎng)小鼠睪丸支持細(xì)胞系TM4細(xì)胞；利用RT-qPCR和Western blot方法檢測(cè)TM4細(xì)胞MRP1 mRNA和蛋白表達(dá)水平；觀察不同濃度、不同時(shí)間鉛處理對(duì)TM4細(xì)胞內(nèi)MRP1表達(dá)的影響。(5)慢病毒干擾構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)MRP1的TM4細(xì)胞構(gòu)建含有MRP1 shRNAs靶序列的穿梭質(zhì)粒,將穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng),收集慢病毒并進(jìn)行病毒滴度檢測(cè)。將含有目的靶基因的病毒液侵染TM4細(xì)胞,通過檢測(cè)GFP熒光表達(dá)測(cè)侵染效率。RT-qPCR與Western blot法驗(yàn)證MRP1表達(dá)抑制率,通過兩種MRP1轉(zhuǎn)運(yùn)底物Calcein和SNARF-1驗(yàn)證MRP1轉(zhuǎn)運(yùn)活性抑制率。用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定低表達(dá)MRP1的細(xì)胞株(本研究中簡(jiǎn)稱TM4-sh細(xì)胞)(6)細(xì)胞內(nèi)鉛蓄積情況的檢測(cè)以0-100μM醋酸鉛分別處理TM4和TM4-sh細(xì)胞12h和24h,原子吸收光譜儀檢測(cè)各濃度組細(xì)胞中鉛含量。分析隨著醋酸鉛處理濃度的增加,TM4細(xì)胞和TM4-sh細(xì)胞中鉛的蓄積情況,并比較TM4細(xì)胞和TM4-sh細(xì)胞中鉛蓄積含量的差異。(7)細(xì)胞內(nèi)鉛排出情況的檢測(cè)分別在TM4和TM4-sh細(xì)胞培養(yǎng)基中加入終濃度20μM的醋酸鉛,培養(yǎng)24小時(shí)后,更換為無鉛培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在更換無鉛培養(yǎng)基后的0、1、3、6、9、12h時(shí)間點(diǎn)時(shí)收集細(xì)胞。原子吸收光譜儀測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)上細(xì)胞中的鉛殘留量,比較TM4細(xì)胞和TM4-sh細(xì)胞中鉛排出情況。類同的實(shí)驗(yàn)過程觀察和分析MRP1活性抑制劑(MK571)、GSH生物合成抑制劑(BSO)、GST活性抑制劑(EA)和能量抑制劑(NaN3)對(duì)TM4細(xì)胞鉛排出的影響。(8)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)SPSS (version 17.0 for Windows, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。用非配對(duì)t檢驗(yàn)比較兩組間均數(shù)的差異；用ANOVA(Tukey's post hoc test)分析三組以及三組以上均數(shù)之間的差異。所得數(shù)據(jù)用nean±SD表示,P0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：(1)小鼠MRP1蛋白的同源建模與基于分子對(duì)接的虛擬篩選通過SYBYL軟件對(duì)小鼠的MRP1蛋白進(jìn)行同源建模,并對(duì)構(gòu)建的模型進(jìn)行優(yōu)化,然后繪制出小鼠MRP1蛋白的三維結(jié)構(gòu)。并通過Ramchandran (Psi-Phi)和ProSA網(wǎng)站對(duì)構(gòu)建的MRP1結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果顯示構(gòu)建的蛋白結(jié)構(gòu)模型中幾乎所有的氨基酸殘基(97.55%)均位于可接受的范圍內(nèi)；通過對(duì)模型的能量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),構(gòu)建的蛋白模型中保守區(qū)域的能量較低,說明模型的保守區(qū)域相對(duì)穩(wěn)定。綜上結(jié)果說明本研究中構(gòu)建的小鼠MRP1蛋白三維結(jié)構(gòu)模型成功。將ZINC的生物合成小分子庫(kù)中的180313個(gè)小分子化合物分別與MRP1進(jìn)行基于分子對(duì)接的虛擬篩選,并列出與MRP1對(duì)接總評(píng)分前十的化合物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GSH與MRP1的對(duì)接總評(píng)分為9.448,位居第八。GSH是與MRP1對(duì)接評(píng)分前十的化合物中唯一含有巰基的化合物,它被認(rèn)為在MRP1轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬的過程中發(fā)揮著重要的作用,該結(jié)果也為探索GSH參與MRP1轉(zhuǎn)運(yùn)底物的機(jī)制提供了基于結(jié)構(gòu)的理論基礎(chǔ)。(2)TM4細(xì)胞具有MRP1的轉(zhuǎn)運(yùn)活性,鉛能夠誘導(dǎo)MRP1轉(zhuǎn)運(yùn)活性的增加在TM4細(xì)胞中加入0-100μM劑量濃度范圍內(nèi)的MRP1的活性抑制劑(MK571),檢測(cè)Calcein和SNARF-1的熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示MK571能夠劑量依賴性的增加TM4細(xì)胞內(nèi)Calcein和SNARF-1的含量,即加入MRP1活性抑制劑MK571后,細(xì)胞中殘留的MRP1轉(zhuǎn)運(yùn)底物含量增加。該結(jié)果說明TM4細(xì)胞具有MRP1的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。在TM4細(xì)胞中加入一定濃度范圍的醋酸鉛,觀察到隨著加入醋酸鉛濃度的增加,細(xì)胞內(nèi)殘留的Calcein和SNARF-1的量下降,并呈劑量依賴關(guān)系。該結(jié)果表明鉛能夠誘導(dǎo)TM4細(xì)胞中MRP1的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。(3)鉛能夠誘導(dǎo)小鼠中MRP1的mRNA與蛋白表達(dá)水平的改變?cè)赥M4細(xì)胞中分別加入0-100pM的醋酸鉛,細(xì)胞存活率呈先上升后下降的趨勢(shì),且當(dāng)加入的醋酸鉛濃度達(dá)到100μM時(shí),細(xì)胞的存活率只有54%(P0.05)。隨著給予鉛濃度的增加,MRP1 mRNA表達(dá)水平呈先升高后降低的趨勢(shì),且與對(duì)照組(OμM組)相比,給予20、40和80μM的醋酸鉛,MRP1 mRNA表達(dá)分別相對(duì)增高了7、10和7倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。以20μM醋酸鉛分別處理TM4細(xì)胞3、6、12、24和48小時(shí),結(jié)果顯示鉛處理超過24小時(shí)后,MRP1 mRNA的表達(dá)水平顯著增加(P0.05)。時(shí)間和劑量曲線顯示MRP1蛋白表達(dá)水平變化趨勢(shì)與mRNA水平變化趨勢(shì)一致,然而蛋白水平變化的倍數(shù)沒有mRNA改變的明顯。(4)通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)成功構(gòu)建了穩(wěn)定低表達(dá)MRP 1的TM4細(xì)胞根據(jù)基因庫(kù)小鼠MRP1基因(Gene ID:NM 008576.3)序列,設(shè)計(jì)4個(gè)靶點(diǎn)干擾序列,采用慢病毒載體技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)MRP1的TM4細(xì)胞4個(gè)候選株。根據(jù)RT-qPCR和Western blot驗(yàn)證,結(jié)果確定出MRP1表達(dá)敲低效果最為明顯的一株,并命名為TM4-sh細(xì)胞。RT-qPCR和Western blot的結(jié)果顯示：TM4-sh細(xì)胞中MRP1的mRNA和蛋白表達(dá)均較TM4細(xì)胞分別降低了73%和75%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。MRP1的特異轉(zhuǎn)運(yùn)底物SNARF-1和Calcein在TM4-sh細(xì)胞內(nèi)未轉(zhuǎn)運(yùn)量較TM4細(xì)胞顯著增加(P0.01),且TM4-sh細(xì)胞中的SNARF-1未轉(zhuǎn)運(yùn)量高出TM4細(xì)胞350%。這些結(jié)果證實(shí)本研究中構(gòu)建的TM4-sh細(xì)胞被有效地敲低了MRP1基因表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)活性。(5)鉛在TM4-sh細(xì)胞中的蓄積量顯著高于TM4細(xì)胞,且鉛的蓄積與鉛處理濃度呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。以0-100μM醋酸鉛分別培養(yǎng)TM4和TM4-sh細(xì)胞,在12和24小時(shí)后,檢測(cè)各濃度組細(xì)胞中的鉛含量。結(jié)果顯示隨著鉛濃度增加,細(xì)胞內(nèi)的鉛蓄積量明顯增加(P0.05)。與TM4細(xì)胞組相比,TM4-sh細(xì)胞中的鉛蓄積更加明顯；尤其以10-40μM的醋酸鉛處理細(xì)胞12和24小時(shí)后,TM4-sh細(xì)胞中的鉛含量較TM4細(xì)胞中高出2到8倍(P0.05)。(6)敲低TM4細(xì)胞的MRP1表達(dá)水平或抑制MRP1活性能顯著延緩細(xì)胞內(nèi)鉛的排出根據(jù)細(xì)胞存活率和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以20μM醋酸鉛分別處理TM4和TM4-sh細(xì)胞24小時(shí),然后更換為無鉛培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)0、1、3、6、9和12小時(shí)。收集各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鉛殘留量,結(jié)果以0時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)鉛含量的百分比表示。結(jié)果顯示更換為無鉛培養(yǎng)基1小時(shí)后,TM4-sh細(xì)胞內(nèi)仍然殘留有75.0%的鉛,較同時(shí)間點(diǎn)TM4細(xì)胞鉛高出41.8%。在隨后的3、6、9h時(shí)點(diǎn), TM4-sh細(xì)胞內(nèi)持續(xù)顯示含有較高的鉛殘留量,且較TM4細(xì)胞平均高出23.4%(包括1h時(shí)點(diǎn)),各時(shí)點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。同樣以20μM醋酸鉛處理TM4細(xì)胞24h后,更換含MRP1活性抑制劑(MK571)的無鉛培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)0、1、3、6、9和12小時(shí),MK571組在第3-12小時(shí)各點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)鉛的相對(duì)殘留量均高于對(duì)照組(P0.05)。(7)GSH和GST參與TM4細(xì)胞鉛排出,且鉛排出依賴ATP加入1mM的ATP的抑制劑(NaN3)培養(yǎng)24小時(shí)與對(duì)照組(0mM的NaN3)相比細(xì)胞內(nèi)ATP含量顯著降低(P0.01)。加入NaN3組,細(xì)胞中ATP含量只有對(duì)照組的48.7%。加入25μM GSH的抑制劑(BSO)培養(yǎng)24小時(shí),較對(duì)照組(0μMBSO)相比細(xì)胞內(nèi)GSH含量顯著降低(P0.01),且只有對(duì)照組細(xì)胞中GSH含量的52.3%；加入50μM GST的抑制劑(EA)后,與對(duì)照組(OμM EA)相比細(xì)胞中GST活性顯著降低(P0.01),只有對(duì)照組細(xì)胞中的GST活性的28.7%。TM4細(xì)胞經(jīng)20μM醋酸鉛培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后,棄掉舊培養(yǎng)基,分別換用含有或不含有GSH合成抑制劑BSO、GST活性抑制劑EA和能量抑制劑NaN。的無鉛培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),并分別在更換培養(yǎng)基后第0、1、3、6、9和12小時(shí)收集細(xì)胞,原子吸收分光光度法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鉛殘留量。在同一處理組內(nèi),隨著排鉛時(shí)間的延長(zhǎng),各處理組鉛的相對(duì)殘留量呈現(xiàn)先急后緩的下降趨勢(shì),其中第0小時(shí)至第3小時(shí)內(nèi)降速明顯,3小時(shí)后降速緩慢。在排鉛的第1-9小時(shí)各時(shí)點(diǎn),NaN。組細(xì)胞中鉛相對(duì)殘留量顯著高于對(duì)照組(不含NaN3組),P0.01；在排鉛的第3-12小時(shí)各時(shí)點(diǎn),BSO組細(xì)胞內(nèi)鉛相對(duì)殘留量均高于對(duì)照組(不含BSO組),P0.01；在排鉛的第3和9小時(shí)時(shí)點(diǎn)上,EA組細(xì)胞內(nèi)鉛的相對(duì)殘留量也均高于對(duì)照組(不含EA組),P0.05。這些結(jié)果說明GSH含量的降低、抑制GST活性和抑制細(xì)胞需要的能量都不利于TM4細(xì)胞內(nèi)鉛的外排。結(jié)論：(1)MRP1蛋白三維結(jié)構(gòu)與GSH具有較強(qiáng)的結(jié)合力。因此,MRP1可能具有轉(zhuǎn)運(yùn)GSH結(jié)合物的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。(2)TM4細(xì)胞具有MRP1的轉(zhuǎn)運(yùn)活性,鉛能夠影響TM4細(xì)胞中MRP1的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。且鉛能夠誘導(dǎo)TM4細(xì)胞中MRP1的mRNA和蛋白表達(dá)水平的改變。(3)本研究通過慢病毒干擾技術(shù)成功構(gòu)建了穩(wěn)定低表達(dá)MRP1的TM4細(xì)胞(TM4-sh)。TM4-sh細(xì)胞中MRP1的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低,且MRP1的轉(zhuǎn)運(yùn)活性也被明顯抑制。(4)敲低TM4細(xì)胞的MRP1表達(dá)水平或抑制其活性能夠顯著增加鉛在細(xì)胞中蓄積,并延緩細(xì)胞內(nèi)鉛的排出。GSH含量的降低、抑制GST活性或者抑制細(xì)胞需要的能量都不利于TM4細(xì)胞內(nèi)鉛的外排。因此,MRP1參與了TM4細(xì)胞鉛轉(zhuǎn)運(yùn),且依賴于ATP和GSH。
【圖文】：

同源建模過程包含六個(gè)步驟；（１）搜索模板，同源識(shí)別；（２）調(diào)整目標(biāo)序逡逑列的模板結(jié)構(gòu)，序列比對(duì)；（３）構(gòu)建模型保守區(qū)域；（４）構(gòu)建可變循環(huán)區(qū)域；逡逑（５）添加側(cè)鏈，，優(yōu)化模型；（６）評(píng)估模式。見流程圖１－１。逡逑ｊ邐Ｔａｒｇ＂邋Ｓ邋巧邋ｕｅｎｃａ邐ＴｓｍｐｌａｔＢ邋Ｓｔｍｃ邋山？逡逑

本文編號(hào)：2565015