發(fā)布時間：2019-05-31 00:36

【摘要】：研究背景 鉛是工業(yè)上常用的重金屬之一,可以通過呼吸和消化系統(tǒng)進入人體。鉛具有很強的神經(jīng)毒性,可導(dǎo)致不可逆的神經(jīng)系統(tǒng)損傷,兒童在發(fā)育期對鉛暴露產(chǎn)生的毒性尤為敏感�？茖W(xué)家們發(fā)現(xiàn)即使兒童的血鉛濃度保持在可接受水平,兒童的智力發(fā)育仍會受到明顯影響。因此,鉛的神經(jīng)毒性受到了廣泛關(guān)注。 細(xì)胞生長的微環(huán)境是保持細(xì)胞正常增殖、分化、代謝和功能活動的重要條件。細(xì)胞對外界的微環(huán)境非常敏感,在同一共培養(yǎng)體系中,細(xì)胞之間或細(xì)胞與胞外基質(zhì)之間的直接接觸可以影響細(xì)胞的生長狀態(tài)。近幾十年來,在放射生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)現(xiàn),當(dāng)少數(shù)細(xì)胞受到射線照射時,沒有受到射線直接照射的周圍細(xì)胞也能表現(xiàn)出一些損傷效應(yīng)。大量研究已經(jīng)證明在體內(nèi)和體外實驗中確實存在損傷傳遞效應(yīng)。例如,慢性粒細(xì)胞白血病患兒的脾部在接受放射線照射治療時,胸骨骨髓細(xì)胞發(fā)生了損傷；局部氧化損傷可以通過GJIC在內(nèi)皮細(xì)胞之間傳遞。有人提出用腫瘤自殺基因治療腫瘤,當(dāng)部分腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染自殺基因后,在藥物啟動轉(zhuǎn)染細(xì)胞自殺后,轉(zhuǎn)染細(xì)胞及周圍未轉(zhuǎn)染細(xì)胞均被殺滅。近年來,有人發(fā)現(xiàn)局部氧化損傷可以通過細(xì)胞間縫隙連接通訊(GJIC)在上皮細(xì)胞間傳遞。以上所述存在著一個共同的現(xiàn)象,就是某些有害因素引起的靶細(xì)胞損傷不僅僅局限于靶細(xì)胞本身,還可以引起周圍正常細(xì)胞產(chǎn)生損傷。暴露于有害因素的細(xì)胞群會h出現(xiàn)明顯的生物效應(yīng),這種效應(yīng)在暴露細(xì)胞群和周圍未暴露細(xì)胞群都會發(fā)生,這一現(xiàn)象人們稱之為旁觀者效應(yīng)(bystander effect,BE)。旁觀者效應(yīng)是指正常細(xì)胞在直接受到有害因素?fù)p害的靶細(xì)胞誘導(dǎo)下發(fā)生的諸如細(xì)胞死亡、基因突變、染色體不穩(wěn)定等反應(yīng),這些經(jīng)誘發(fā)而發(fā)生效應(yīng)的正常細(xì)胞成為旁觀者細(xì)胞。由于旁觀者效應(yīng)的存在,使靶細(xì)胞的損傷效應(yīng)得以延續(xù)與放大,從而使損傷明顯加重。這些研究提醒人們：機體對損傷的反應(yīng)不僅僅是單個獨立細(xì)胞或者組織,而是具有群體性。 對于旁觀者效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)已有幾十年,但至今為止,旁觀者效應(yīng)的確切機制尚未闡明。越來越多研究表明,旁觀者效應(yīng)可能與縫隙連接蛋白(connexin, Cx)介導(dǎo)的細(xì)胞間隙連接通訊(gap-junctional intercellular communication, GJIC)有密切關(guān)系�？p隙連接蛋白是構(gòu)成細(xì)胞間縫隙連接通道基本結(jié)構(gòu)和功能的一類膜蛋白。由六個穿膜的縫隙連接蛋白組成中空的親水性六聚體結(jié)構(gòu)叫做連接小體(connexon)或縫隙連接半通道(gap junction hemichannel)。在正常情況下,細(xì)胞膜對應(yīng)面上的一對連接小體組成了GJ通道,它能允許分子量低于1KD或直徑小于1.5nm的小分子物質(zhì)如代謝分子、離子、第二信使(如Ca2+、ATP)等通過,這些小分子參與細(xì)胞間物質(zhì)交換的代謝藕聯(lián)和電信號傳遞的電藕聯(lián),進行細(xì)胞間信息傳遞,從而在細(xì)胞的分化、生長、生理功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。 鉛毒物可增加細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)的水平,同時減少抗氧化物質(zhì)的濃度活性,破壞氧化、抗氧化平衡,導(dǎo)致氧化損傷,誘發(fā)細(xì)胞凋亡。同時鉛還可通過影響一些相關(guān)基因的表達,影響細(xì)胞凋亡。目前鉛誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機理的研究已經(jīng)取得了許多進展,但尚不完善,鉛中毒是否會發(fā)生旁觀者效應(yīng)未見報道,鉛中毒的毒性代謝產(chǎn)物能否通過間隙連接細(xì)胞間通訊(GJIC)進行傳導(dǎo)等問題仍有待于深入研究。 綜上所述,我們選擇神經(jīng)元模式細(xì)胞-大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PCl2)為研究對象,希望通過對染毒細(xì)胞與未染毒細(xì)胞共培養(yǎng)體系的研究,對醋酸鉛誘導(dǎo)PC12細(xì)胞旁觀者效應(yīng)的過程有一個系統(tǒng)、完整的認(rèn)識,同時為防治鉛中毒的下一步研究提供依據(jù)。 研究目的： 1、利用直接接觸混合共培養(yǎng)技術(shù),構(gòu)建可以區(qū)分醋酸鉛染毒與未染毒PC12細(xì)胞的共培養(yǎng)體系； 2、通過混合共培養(yǎng)體系,觀察醋酸鉛染毒PC12細(xì)胞對周邊正常PC12細(xì)胞的影響； 3、研究縫隙連接蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞間縫隙連接是否參與醋酸鉛誘導(dǎo)的旁觀者效應(yīng),旨在探討醋酸鉛誘導(dǎo)PC12細(xì)胞旁觀者效應(yīng)可能的毒理機制。 研究方法： 1、確定醋酸鉛的細(xì)胞毒性并篩選適合誘導(dǎo)PC12旁觀者效應(yīng)的醋酸鉛濃度 (1)細(xì)胞增殖能力檢測 按照醋酸鉛濃度將細(xì)胞分成5個實驗組(0、0.01、0.1、1、10、100μM),通過MTT比色法,檢測不同濃度醋酸鉛對PC12細(xì)胞增殖能力的影響。分別以每孔5x103個細(xì)胞接種到96孔板,暴露于不同濃度的醋酸鉛,每孔加MTI昒液20ul,繼續(xù)培養(yǎng)24h后終止培養(yǎng),棄培養(yǎng)上清液,每孔加150ul二甲基亞砜(DMSO),置搖床上低速振蕩10min,使結(jié)晶物充分融解,選擇490nm波長,通過酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀測定各孔光吸收值。 (2)ROS水平檢測 將PC12細(xì)胞分成2個實驗組：PC12、PC12(10μM Pb處理)。各組細(xì)胞孵育24h融合后進行實驗,棄培養(yǎng)液,室溫下D-Hank's漂洗3次,加入含有10μMDHE熒光探針無血清DMEM培養(yǎng)液1mL,37℃避光孵育20min,用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次,0.25%胰蛋白酶消化,加入1mL無血清培養(yǎng)液吹打均勻,染色完畢后進行Hoechst33342染色。通過熒光顯微鏡,觀察細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測。激發(fā)波長480～535nm,最大發(fā)射波長590nm～610nm; Hoechst33342的最大激發(fā)波長為350nm,最大發(fā)射波長為460nm。 (3)凋亡相關(guān)蛋白檢測 按照醋酸鉛濃度將細(xì)胞分成5個實驗組(0、0.01、0.1、1、10、100μM),通過RT-PCR,檢測凋亡相關(guān)基因(Bax, Bcl-2)的mRNA表達水平,以β-actin做內(nèi)參照。根據(jù)NCBI所提供的基因序列,通過引物設(shè)計軟件Primer3設(shè)計相應(yīng)引物,擴增條件為預(yù)變性：94℃for5min;變性94℃30s,退火60℃30s,延伸72℃1mmin,30個循環(huán)；后延伸72℃5min。 (4)細(xì)胞凋亡檢測 按照醋酸鉛濃度將細(xì)胞分成5個實驗組(0,0.01,0.1,1,10,100μM),通過Annexin v-PE/7-AAD試劑盒,檢測PC12細(xì)胞凋亡情況。收集1～5×105細(xì)胞；加入500μL的Binding Buffe懸浮細(xì)胞；加入1μL Annexin V-PE混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15min；加入5μL7-AAD染液,混勻；室溫、避光、反應(yīng)5-15min；在1h內(nèi)完成流式細(xì)胞儀的檢測。 (5)線粒體跨膜電位 將細(xì)胞分成3個實驗組：PC12、GFP-PC12、GFP-PC12(10μM Pb處理)將各組細(xì)胞培養(yǎng)24h后,分別加入20nM TMRM,通過流式細(xì)胞儀檢測線粒體跨膜電位。 (6)NAC處理 將細(xì)胞分成3個實驗組：PC12、PC12+10μM Pb、PC12(NAC處理)+10μMPb,分別檢測各組細(xì)胞ROS、線粒體膜電位、凋亡水平(方法同上)。 2、構(gòu)建染毒細(xì)胞與正常細(xì)胞共培養(yǎng)體系,并觀察檢測醋酸鉛誘導(dǎo)PC12旁觀者效應(yīng) (1)構(gòu)建EF1A-eGFP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞株 將處于對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞吸去培養(yǎng)液,用PBS洗滌后加入適量Trypsin-EDTA,消化后移至離心管中,取1×105cells/9.6cm2的密度接種至六孔板,待細(xì)胞完全貼壁后,即可進行轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)導(dǎo)前,每孔細(xì)胞換成1.5mL新鮮的HD+10%FBS培養(yǎng)基或1640+20%FBS培養(yǎng)基,每株各選取一孔細(xì)胞加入30μL的Lenti-eGFP/Neo,充分的搖勻后放入37℃、5%CO2、95%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)導(dǎo)7小時后,吸去含有Lenti-eGFP/Neo的完全培養(yǎng)基,換成新鮮的HD+10%FBS培養(yǎng)基或1640+20%FBS培養(yǎng)基,放入37℃、5%CO2、95%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)導(dǎo)48小時后,于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)導(dǎo)效果。 (2)細(xì)胞混合培養(yǎng)熒光顯微鏡觀測 將PC12、GFP-PC12按比例混合培養(yǎng),用PBS制備50μM Hoechst33342染料,在37℃培養(yǎng)細(xì)胞20分鐘,用PBS沖洗細(xì)胞兩次,用帶有350nm激發(fā)波長,460nm發(fā)射波長的濾光片的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。 (3)共培養(yǎng)體系ROS水平、凋亡水平、線粒體跨膜電位檢測： 將細(xì)胞分成2個實驗組組：GFP-PC12+PC12、GFP-PC12(10μMPb處理)+PC12。分別進行ROS水平、凋亡水平、線粒體跨膜電位檢測(方法同上)。 3、GJIC在醋酸鉛誘導(dǎo)PC12旁觀者效應(yīng)中的作用研究 (1)共培養(yǎng)體系縫隙連接功能檢測 將細(xì)胞分成2個實驗組：GFP-PC12(10μMMPb處理)+PC12、GFP-PC12(10μMPb處理)+PC12+CBX;通過細(xì)胞接種熒光示蹤法(Parachute Assay)檢測細(xì)胞間熒光傳遞功能,即細(xì)胞GJ功能。 (2) GJIC阻斷劑甘珀酸(CBX)對旁觀者效應(yīng)的影響 將細(xì)胞分成2個實驗組:GFP-PC12+PC12、GFP-PC12(10μMPb處理)+PC12、GFP-PC12(10μMPb處理)-PC12+CBX。分別進行ROS、凋亡、線粒體跨膜電位檢測(方法同上)。 4、數(shù)據(jù)處理 上述實驗至少重復(fù)三次。各組間的檢驗如方差齊則采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD方法；如方差不齊則采用Welch方法,兩兩比較采用Dunnett-T3方法,實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。全部實驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析,p0.05視為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 主要結(jié)果： 1、醋酸鉛引起PC12細(xì)胞增殖能力顯著下降,凋亡水平上升。 MTT法檢測結(jié)果顯示各劑量組細(xì)胞活性之間有顯著性差異(F值=386.421,P=0.000),其中暴露于1μm醋酸鉛的PC12細(xì)胞增殖能力降低(95.0%±3.8%),與對照組比較有顯著性差異(P=0.04),而暴露于10μM和100μm醋酸鉛的PC12細(xì)胞增殖能力分別為69.8%±2.8%和51.4%±3.8%(P=0.00；P=0.00)。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,0.1μM、1μM、10μM, and100μM暴露組的凋亡率分別為1.33%±0.42%,5.40%±0.51%,38.33%±3.06%,46.67%±4.51%。說明隨著醋酸鉛染毒濃度的升高,細(xì)胞的增殖能力逐漸下降,凋亡水平逐步升高。 2、醋酸鉛引起PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax表達上升,Bcl-2表達下降,Bax/Bcl-2比值上升,并呈劑量反應(yīng)關(guān)系。 RT-PCR分析結(jié)果顯示,各劑量組細(xì)胞Bax基因mRNA表達之間有顯著性差異(Welcl值=103.674,P=0.000),其中1μM、10μM、100μM組細(xì)胞Bax基因mRNA表達與對照組細(xì)胞比較有顯著性差異(P=0.011；P=0.034；P=0.008),說明隨著醋酸鉛濃度增高,細(xì)胞Bax基因mRNA表達逐漸下降。各劑量組細(xì)胞Bcl-2基因mRN表達之間有顯著性差異(Welch值=363.691,P=0.000),其中10μ M、100μm組細(xì)胞Bcl-2基因,mRJA表達與對照組細(xì)胞比較有顯著性差異(P=0.049；P=0.027),說明隨著醋酸鉛濃度增高,細(xì)胞Bcl-2基因mRNA表達逐漸升高。 3、抗氧化劑N-乙�；腚装彼�(NAC)可以抑制醋酸鉛引起的ROS水平增高、線粒體跨膜電位降低及細(xì)胞凋亡。 經(jīng)過NAC預(yù)處理后,熒光顯微鏡下,NAC預(yù)處理組ROS生成水平明顯低于未處理組(P=0.000)；線粒體跨膜電位NAC預(yù)處理組高于未處理組(P=0.000)；暴露10μM醋酸鉛的PC12細(xì)胞凋亡率下降至14.33%±1.53%。 4、通過EF1A-EGFP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞,構(gòu)建了共培養(yǎng)體系,在熒光顯微鏡下可以區(qū)分染毒與未染毒細(xì)胞。 熒光顯微鏡下,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞呈現(xiàn)綠色加藍色核染,而正常細(xì)胞僅為藍色核染。 5、細(xì)胞熒光免疫示蹤法(Parachute Assay)顯示GFP-PC12(Pb2+)細(xì)胞和PC12細(xì)胞之間建立了細(xì)胞間隙連接通訊。 熒光顯微鏡下穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞將綠色染料傳遞給周圍正常細(xì)胞,CBX可以有效組織這種傳遞。說明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞與正常細(xì)胞之間建立了縫隙連接。 6、GJIC阻斷劑甘珀酸(CBX)可以部分阻斷醋酸鉛誘發(fā)的旁觀者效應(yīng) 在共培養(yǎng)體系中,ROS水平GJIC阻斷劑甘珀酸(CBX)處理前PC12細(xì)胞的(3.48±0.59),處理后為(1.64±0.42),差異有顯著性(P=0.000)。凋亡水平GJIC阻斷劑甘珀酸(CBX)處理前為(43.52%±8.07%),處理后為(12.19%±1.13%),差異有顯著性(P=0.000)。線粒體跨膜電位處理前低于處理后。 結(jié)論： 1、醋酸鉛可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的線粒體途徑。 2、醋酸鉛對PC12細(xì)胞造成的損傷可以傳遞給周圍正常細(xì)胞。 3、細(xì)胞間隙連接通訊GJIC在鉛誘導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)中起了重要的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R135.1

【參考文獻】

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1 洪濤;何安慰;盧明巍;蔣麗萍;;縫隙連接通訊抑制劑對Cx43cDNA轉(zhuǎn)染后化療旁觀者效應(yīng)的影響[J];中國神經(jīng)腫瘤雜志;2006年04期

2 聞海兵;李嘉杰;鄒樹峰;嚴(yán)劍;魏敏俊;劉先波;頡奎;洪濤;;轉(zhuǎn)染縫隙連接蛋白CX43在腦膠質(zhì)瘤化療旁觀者效應(yīng)影響的體外實驗研究[J];中國神經(jīng)腫瘤雜志;2011年02期

3 劉建安,劉德華,靜進,易歡瓊,王夢龍,陳學(xué)彬;兒童低水平鉛暴露與神經(jīng)行為關(guān)系的研究[J];中國當(dāng)代兒科雜志;2002年04期

4 孫瑩;蔣莉;;鉛影響海馬長時程增強機制研究進展[J];兒科藥學(xué)雜志;2006年06期

5 馮豐;金屬元素與細(xì)胞凋亡[J];國外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊);2000年04期

6 周桂鳳;劉棟;蔣云生;;鉛結(jié)合蛋白研究進展[J];國外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊);2006年02期

7 王中堂;唐憲民;李寶生;;放射誘導(dǎo)旁觀者效應(yīng)的研究進展[J];國際腫瘤學(xué)雜志;2006年05期

8 楊櫟;余時滄;;線粒體DNA損傷與細(xì)胞凋亡[J];標(biāo)記免疫分析與臨床;2013年05期

9 張正潔,李東紅,許增貴;我國鉛污染現(xiàn)狀、原因及對策[J];環(huán)境保護科學(xué);2005年04期

10 徐進,徐立紅,鄭一凡,邢鳴鸞,唐建剛,俞智勇;鉛暴露引起的小鼠肝臟抗氧化系統(tǒng)損傷[J];環(huán)境科學(xué)學(xué)報;2004年06期

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本文編號：2489300