【摘要】：研究背景： 食品化學(xué)污染物是食源性疾病的重要病因之一,食品化學(xué)污染物包括重金屬、農(nóng)藥、毒素以及食品加工過程中形成的有毒有害物質(zhì)等,然而,人們以往對這些物質(zhì)對機(jī)體健康影響的研究往往過多關(guān)注其對健康影響的傳統(tǒng)毒性,對其潛在危害如：免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)發(fā)育系統(tǒng)等特殊毒性影響卻研究不多。丙烯酰胺是高溫烹飪的淀粉類食品中常見的食品內(nèi)源性污染物之一,已有大量研究數(shù)據(jù)顯示,丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性、發(fā)育毒性和生殖毒性,而有關(guān)免疫毒性缺乏系統(tǒng)性研究；因此本研究對丙烯酰胺的免疫毒性從體液免疫、細(xì)胞免疫、非特異性免疫等幾方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究。2014年國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評估專家委員會也將丙烯酰胺列為優(yōu)先評估項(xiàng)目,將對丙烯酰胺進(jìn)行重新評估,目前正廣泛收集丙烯酰胺的相關(guān)毒性資料,本研究結(jié)果也將為丙烯酰胺對健康影響的風(fēng)險(xiǎn)評估提供毒理學(xué)的科學(xué)數(shù)據(jù)。 隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和生活水平的提高,消費(fèi)者對食品的要求也逐步提高,藥食兩用物質(zhì)由于其具有提高機(jī)體免疫力和特殊的營養(yǎng)功效,受到各國食品行業(yè)的青睞。然而藥食兩用物質(zhì)雖然具有較高的開發(fā)和利用價(jià)值,但是由于其成分的復(fù)雜性,如果大量服用,均可引發(fā)潛在危害甚至死亡,因此藥食兩用物質(zhì)進(jìn)行安全性評價(jià)的同時,也需要關(guān)注其神經(jīng)毒性、免疫毒性、內(nèi)分泌干擾作用等特殊毒性,從而為該類物質(zhì)作為新藥開發(fā)或者保健型食品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。苦瓜是近年來備受關(guān)注的藥食兩用物質(zhì)之一,然而大部分研究多集中于對苦瓜及其提取物的功效研究方面,對于苦瓜及其提取物對免疫毒性的研究報(bào)道還很少,因此本研究選擇苦瓜提取物作為受試物,全面評價(jià)苦瓜提取物對BALB/c小鼠免疫功能的影響。 機(jī)體的免疫系統(tǒng)是毒性物質(zhì)最直接的攻擊目標(biāo),繼而引發(fā)機(jī)體出現(xiàn)不良反應(yīng),包括健康并發(fā)癥如：易感性增加、癌癥、過敏性反應(yīng)和自身免疫性疾病的產(chǎn)生等等,因此在外源性化學(xué)物誘發(fā)機(jī)體出現(xiàn)一些不良反應(yīng)之前,免疫系統(tǒng)已經(jīng)表現(xiàn)為受到損害(淋巴結(jié)細(xì)胞構(gòu)成改變、淋巴細(xì)胞亞群改變、宿主抵抗力下降、特異性免疫功能應(yīng)答改變等),因此免疫系統(tǒng)的毒性改變是某些外源性化學(xué)物安全性評價(jià)中較為敏感的指標(biāo),對物質(zhì)進(jìn)行免疫毒理學(xué)評價(jià)是十分必要的。 研究目的： (1)參照ICH提出的免疫毒性評價(jià)指導(dǎo)原則,通過體液免疫、細(xì)胞免疫、非特異性免疫及附加免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的檢測指標(biāo),對丙烯酰胺的免疫毒性進(jìn)行評價(jià),并且初步探究了丙烯酰胺的免疫毒性靶點(diǎn)及其可能的毒性機(jī)制,完善其免疫毒理學(xué)資料,并為今后對丙烯酰胺對健康的風(fēng)險(xiǎn)評估提供科學(xué)數(shù)據(jù)。 (2)參照ICH提出的免疫毒性評價(jià)指導(dǎo)原則,通過體液免疫、細(xì)胞免疫、非特異性免疫及附加免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的檢測指標(biāo),對苦瓜提取物進(jìn)行免疫毒性評價(jià),為進(jìn)一步評價(jià)苦瓜提取物的食用安全性評價(jià)提供免疫毒理學(xué)資料。 研究方法： (1)丙烯酰胺對BALB/c小鼠免疫毒性的研究選用雌性BALB/c小鼠,動物經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后按體重將動物隨機(jī)分組,每組動物10只,按組分籠飼養(yǎng),每籠5只動物。試驗(yàn)周期為30天。共5個免疫組,分別用于一般毒性和免疫病理學(xué)檢測、體液免疫實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)及附加免疫實(shí)驗(yàn)；每個免疫組設(shè)5個試驗(yàn)組,即陰性對照組(蒸餾水)、丙烯酰胺低劑量組、中劑量組、高劑量組及陽性對照組(環(huán)磷酰胺)。 一般毒性和免疫病理學(xué)指標(biāo)：小鼠體重、免疫器官及其它臟器的重量及臟器系數(shù)；血液學(xué)指標(biāo)；血生化指標(biāo)；肝臟、腎臟、脾臟、胸腺、淋巴結(jié)(頸部淋巴結(jié)、腋下淋巴結(jié)、耳部淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、Peyer氏淋巴結(jié))、骨髓的組織病理學(xué)觀察。體液免疫包括：T細(xì)胞依賴性抗體反應(yīng)(測定脾空斑形成細(xì)胞數(shù),PFC)、血清溶血素的測定和血漿免疫球蛋白水平(酶聯(lián)免疫吸附法法測定血漿IgA、IgM口IgG水平)。細(xì)胞免疫包括：ConA誘導(dǎo)的脾T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)和LPS誘導(dǎo)的脾B淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。非特異性免疫包括：NK細(xì)胞活性的測定和巨噬細(xì)胞功能的測定(小鼠碳廓清試驗(yàn))。附加免疫實(shí)驗(yàn)指標(biāo)：血清細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ、TNF的測定,外周血淋巴細(xì)胞表型分析包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、Th細(xì)胞、Ts細(xì)胞比例,這兩種檢測均采用流式細(xì)胞技術(shù)。 (2)丙烯酰胺免疫毒性機(jī)制的初步探討選用雌性BALB/c小鼠,動物經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后按體重將動物隨機(jī)分組,每組動物10只,按組分籠飼養(yǎng),每籠5只動物。試驗(yàn)周期為30天。設(shè)5個試驗(yàn)組,即陰性對照組(蒸餾水)、丙烯酰胺低劑量組、中劑量組和高劑量組,以及陽性對照組。 試驗(yàn)結(jié)束后,取各組脾臟和胸腺組織,并將脾臟和胸腺切分為兩部分,一部分使用液氮凍存?zhèn)溆�；另一部分�?%甲醛固定作病理分析。通過TUNEL法檢測脾臟和胸腺中的細(xì)胞凋亡水平；RT-PCR方法檢測脾臟、胸腺中Bax、Bcl-2、caspase-3、PARP的mRNA水平,通過Western blotting方法檢測脾臟、胸腺中Bax、Bcl-2、caspase-3、PARP的蛋白表達(dá)水平。 (3)苦瓜提取物對的BALB/c小鼠免疫毒性的研究選用雌性BALB/c小鼠,動物經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后按體重將動物隨機(jī)分組,每組動物10只,按組分籠飼養(yǎng),每籠5只動物。試驗(yàn)周期為30天。共5個免疫組,分別用于一般毒性和免疫病理學(xué)檢測、體液免疫試驗(yàn)、細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)及附加免疫實(shí)驗(yàn)；每個免疫組設(shè)5個試驗(yàn)組,即陰性對照組(蒸餾水)、苦瓜提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組及陽性對照組(環(huán)磷酰胺)。 一般毒性和免疫病理學(xué)指標(biāo)：小鼠體重、免疫器官及其它臟器的重量及臟器系數(shù)；血液學(xué)指標(biāo)；血生化指標(biāo)；肝臟、腎臟、脾臟、胸腺、淋巴結(jié)(頸部淋巴結(jié)、腋下淋巴結(jié)、耳部淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、Peyer氏淋巴結(jié))、骨髓的組織病理學(xué)觀察。體液免疫包括：T細(xì)胞依賴性抗體反應(yīng)(測定脾空斑形成細(xì)胞數(shù),PFC)、血清溶血素的測定和血漿免疫球蛋白水平(酶聯(lián)免疫吸附法法測定血漿IgA、IgM和IgG水平)。細(xì)胞免疫包括：ConA誘導(dǎo)的脾T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)和LPS誘導(dǎo)的脾B淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。非特異性免疫包括：NK細(xì)胞活性的測定和巨噬細(xì)胞功能的測定(小鼠碳廓清試驗(yàn))。附加免疫實(shí)驗(yàn)指標(biāo)：血清細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ、TNF的測定,外周血淋巴細(xì)胞表型分析包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、Th細(xì)胞、Ts細(xì)胞比例,這兩種檢測均采用流式細(xì)胞技術(shù)。 研究結(jié)果： (1)環(huán)磷酰胺作為陽性對照物的研究結(jié)果：本研究中采用環(huán)磷酰胺作為陽性對照物,其一般毒性指標(biāo)和免疫病理學(xué)指標(biāo)的結(jié)果顯示環(huán)磷酰胺陽性對照組peyers結(jié)個數(shù)減少,脾臟絕對重量和相對重量、胸腺絕對重量較陰性對照組顯著性降低。組織病理學(xué)檢測顯示陽性對照組；動物脾臟出現(xiàn)中度萎縮,髓外造血減少,淋巴小結(jié)內(nèi)生發(fā)中心縮小或消失；胸腺出現(xiàn)中或輕度萎縮；Peyer氏淋巴結(jié)萎縮,濾泡結(jié)構(gòu)不清,生發(fā)中心縮小或消失；骨髓造血細(xì)胞減少,且骨髓組織中分葉核細(xì)胞比例增加,其余各系細(xì)胞減少。血液學(xué)結(jié)果顯示,陽性對照組白細(xì)胞數(shù)、平均紅細(xì)胞體積、淋巴細(xì)胞、淋巴細(xì)胞百分比較陰性對照組顯著降低,平均血紅蛋白濃度、血小板平均體積、血小板分布寬度、單核細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞百分比較陰性對照組顯著增高；血生化結(jié)果顯示陽性對照組血清血清白蛋白、血清白球比較陰性對照組顯著降低,血清總膽固醇較陰性對照組顯著升高。細(xì)胞免疫檢測結(jié)果顯示：陽性對照組ConA和LPS誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖能力與陰性對照組比較顯著降低,體液免疫檢測顯示,溶血空斑數(shù)、血清HC50值、血漿IgG和IgM水平較陰性對照組顯著降低。外周血淋巴細(xì)胞分型結(jié)果顯示,陽性對照組小鼠全血總T淋巴細(xì)胞(CD3+CD19-)百分比、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比以及Th/Ts比例均顯著高于陰性對照組；B淋巴細(xì)胞(CD3-CD19+)百分比顯著低于陰性對照組。血清細(xì)胞因子檢測結(jié)果顯示,陽性對照組小鼠血清IL-6水平顯著低于陰性對照組。 (2)丙烯酰胺對BALB/c小鼠的免疫毒性研究結(jié)果：丙烯酰胺的試驗(yàn)結(jié)果如下,丙烯酰胺高劑量組第1周、第2周、第3周、第4周體重均顯著低于陰性對照組,終體重、peyers結(jié)個數(shù)、腎臟絕對重量、脾臟絕對重量和相對重量、胸腺絕對重量和相對重量與陰性對照組相比顯著降低,組織病理學(xué)檢測顯示丙烯酰胺高劑量組：動物脾臟白髓萎縮,其余動物脾臟組織結(jié)構(gòu)清晰,紅髓、白髓及邊緣區(qū)清晰,未見明顯異常。胸腺出現(xiàn)輕度萎縮,淋巴結(jié)(頸部、腋下、耳部、腸系膜淋巴結(jié)),淋巴濾泡萎縮；peyers結(jié)及骨髓組織未見異常；丙烯酰胺低劑量組與中劑量組各組織均未見異常。血液學(xué)結(jié)果顯示,丙烯酰胺中劑量組紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞分布寬度較陰性對照組顯著降低；丙烯酰胺高劑量組紅細(xì)胞數(shù)(血紅細(xì)胞寬度、平均血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞分布寬度、淋巴細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比、單核細(xì)胞百分比較陰性對照組顯著降低,丙烯酰胺高劑量組平均紅細(xì)胞體積較陰性對照組顯著升高；其余指標(biāo)各劑量組與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血生化結(jié)果顯示,丙烯酰胺高劑量組血清總蛋白、血清白蛋白、總膽固醇較陰性對照組顯著增高,血清甘油三酯較陰性對照組降低。細(xì)胞免疫檢測結(jié)果顯示：丙烯酰胺高劑量組小鼠脾T細(xì)胞增殖能力較陰性對照組顯著降低。體液免疫檢測顯示,丙烯酰胺高劑量組血清HCso值較陰性對照組顯著降低。丙烯酰胺不同劑量組對NK細(xì)胞活性無明顯影響。丙烯酰胺三個不同劑量組小鼠全血T淋巴細(xì)胞(CD3+CD19-)百分比均顯著高于陰性對照組。外周血淋巴細(xì)胞分型結(jié)果顯示,丙烯酰胺高劑量組CD4+T淋巴細(xì)胞(CD3+CD4-)百分比明顯高于陰性對照組；丙烯酰胺三個劑量組小鼠全血NK細(xì)胞百分比均顯著低于陰性對照組。血清細(xì)胞因子檢測結(jié)果顯示,丙烯酰胺高劑量組小鼠血清IL-6水平顯著低于陰性對照組；丙烯酰胺高劑量組小鼠血清IL-17水平顯著高于陰性對照組；丙烯酰胺低劑量和中劑量組血清IFN-y水平顯著高于陰性對照組和高劑量組。 (3)丙烯酰胺對BALB/c小鼠免疫毒性的機(jī)制研究：Tunel法檢測結(jié)果顯示,丙烯酰胺中、高劑量組動物脾臟、胸腺的細(xì)胞凋亡率顯著高于陰性對照組；陽性對照組動物脾臟細(xì)胞凋亡率顯著高于陰性對照組；RT-PCR檢測結(jié)果顯示脾臟組織中丙烯酰胺低劑量組及高劑量組Caspase-3的mRNA水平顯著低于陰性對照組,陽性對照組Caspase-3的mRNA水平顯著高于陰性對照組；而胸腺組織中丙烯酰胺低劑量組和陽性對照組PARP的nRNA水平顯著高于陰性對照組。其它各組中Bcl-2、Bax、Caspase-3、PARP基因表達(dá)水平與陰性對照組均未見顯著差異。Western blotting檢測結(jié)果顯示脾臟組織中丙烯酰胺中劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)水平較陰性對照組顯著升高、陽性對照組Bax、PARP蛋白表達(dá)水平較陰性對照組顯著下降,丙烯酰胺各劑量組及陽性對照組Caspase-3蛋白表達(dá)水平較陰性對照組顯著降低；胸腺組織中丙烯酰胺各劑量組和陽性對照組Bcl-2蛋白表達(dá)水平較陰性對照組顯著降低,丙烯酰胺中、高劑量組及陽性對照組PARP蛋白表達(dá)水平較陰性對照組顯著降低,丙烯酰胺各劑量組和陽性對照組Caspse-3蛋白表達(dá)水平較陰性對照組顯著降低,丙烯酰胺中劑量組及陽性對照組Bax蛋白表達(dá)水平較陰性對照組顯著降低。 (4)苦瓜提取物對BALB/c小鼠的免疫毒性研究結(jié)果：一般毒性指標(biāo)和組織病理學(xué)檢測,苦瓜提取物各劑量組動物終體重、Peyer氏淋巴結(jié)數(shù)、臟器重量、肝體比、腎體比、脾體比及腺體比與陰性對照組比較均無顯著性差異；苦瓜提取物各劑量組對BALB/c小鼠肝臟、腎臟、脾臟、胸腺、淋巴結(jié)及骨髓無影響,血常規(guī)和血生化指標(biāo)未見影響。體液免疫檢測顯示,苦瓜提取物中劑量組小鼠血清IgG水平高于陰性對照組,苦瓜提取物高劑量組小鼠血清IgA水平高于陰性對照組。細(xì)胞免疫檢測顯示,苦瓜提取物低劑量組ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖能力較陰性對照組顯著升高。外周血淋巴細(xì)胞分型結(jié)果顯示,苦瓜提取物受試物中劑量組NK細(xì)胞(CD3-CD49+)百分比顯著低于陰性對照組。血清細(xì)胞因子檢測結(jié)果顯示,苦瓜提取物低劑量組IL-6、IL-4、TNF水平顯著高于陰性對照組。 研究結(jié)論： (1)本研究為國內(nèi)外首次對丙烯酰胺的免疫毒性進(jìn)行系統(tǒng)評價(jià),研究發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺對免疫器官脾臟、胸腺、淋巴結(jié)均有明顯的毒性作用,對一些免疫病理學(xué)、細(xì)胞免疫、體液免疫指標(biāo)有明顯抑制作用,但未見其對非特異性免疫功能有明顯毒性作用。在本研究試驗(yàn)條件下,丙稀酰胺在低劑量時即可觀察到小鼠的全血T細(xì)胞和NK細(xì)胞比例顯著降低以及血清細(xì)胞因子IFN-y顯著升高,可以初步得出丙烯酰胺的LOAEL為4mg/kgBW。 (2)凋亡通路可能是丙烯酰胺導(dǎo)致小鼠免疫器官出現(xiàn)損傷的重要作用途徑,是其產(chǎn)生免疫毒性作用的機(jī)制之一。丙烯酰胺對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生毒作用的機(jī)制可能是通過其誘導(dǎo)脾臟和胸腺組織中Caspase-3蛋白的過度活化,并且抑制了胸腺組織Bcl-2的正常表達(dá),使Bcl-2和Bax的相互協(xié)調(diào)作用失衡,導(dǎo)致脾臟和胸腺細(xì)胞過度凋亡,使脾臟和胸腺出現(xiàn)萎縮,最終引發(fā)免疫功能出現(xiàn)障礙；然而該過程中還有許多分子機(jī)制的參與,因此今后還需進(jìn)一步對丙烯酰胺長期暴露對機(jī)體的影響以及全面的分子機(jī)制進(jìn)行探討。 (3)本研究為國內(nèi)外首次對苦瓜提取物的免疫毒性進(jìn)行系統(tǒng)評價(jià),在本研究劑量范圍內(nèi),苦瓜提取物對正常BALB/c小鼠的免疫功能無明顯毒副作用,苦瓜提取物對小鼠血清免疫球蛋白IgA、IgM的產(chǎn)生,以及細(xì)胞因子IL-6、IL-4的分泌有明顯的促進(jìn)作用,苦瓜提取物低劑量組ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖能力較陰性對照組顯著升高,說明苦瓜提取物對小鼠的細(xì)胞免疫、體液免疫有一定的調(diào)節(jié)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2453549