【摘要】：多溴聯(lián)苯醚（polybrominated dipheny1ethers，PBDEs）是一類溴代阻燃劑型（brominated flame retardants，BFRs）化合物，被廣泛作為一類重要的工業(yè)阻燃添加劑加入高分子合成材料中，作為防火材料廣泛地應(yīng)用于多種工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域。由于沒(méi)有化學(xué)鍵的束縛，PBDEs易從產(chǎn)品中遷移出來(lái)進(jìn)入環(huán)境介質(zhì)，導(dǎo)致環(huán)境污染。目前，世界上很多國(guó)家已經(jīng)從空氣、水、土壤、食物等多種環(huán)境介質(zhì)以及人群的血液、乳汁、脂肪等組織中發(fā)現(xiàn)了PBDEs的存在。由于PBDEs是一類持久性有機(jī)污染物，其在環(huán)境介質(zhì)中的含量呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)。PBDEs的殘留性和毒性很可能給環(huán)境和人體健康造成嚴(yán)重影響，其健康危害日益引起國(guó)際社會(huì)的廣泛關(guān)注。 近年來(lái)，大量體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)，PBDEs可引起神經(jīng)毒性、生殖毒性、肝腎毒性、免疫毒性和致癌性等。由于PBDEs可通過(guò)胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)和乳汁排泄、加上嬰幼兒特有的手－口行為和頻繁的地面接觸及排泄PBDEs能力較成年人差等原因，致使嬰幼兒體內(nèi)PBDEs水平高于其它年齡段人群。嬰幼兒期是大腦快速發(fā)育時(shí)期，因而在PBDEs導(dǎo)致的多種毒性作用中，神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育毒性尤其受到人們的關(guān)注。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，在鼠大腦發(fā)育的關(guān)鍵期，暴露于于近似人體負(fù)荷量的PBDEs同系物，可損害實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦部運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知區(qū)域，表現(xiàn)為自發(fā)行為異常，感覺(jué)運(yùn)動(dòng)障礙，學(xué)習(xí)記憶能力下降，并伴隨染毒劑量增加或年齡增長(zhǎng)而呈現(xiàn)惡化的趨勢(shì)。PBDEs如何引起大腦形態(tài)和功能的異常是當(dāng)前PBDEs神經(jīng)毒性作用研究的熱點(diǎn)之一，但PBDEs可通過(guò)哪些途徑影響自主行為和學(xué)習(xí)記憶的機(jī)制目前仍不清楚。 PBDEs可引起神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增多，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的始發(fā)因素，繼而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用。有關(guān)PBDEs實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，PBDEs可以引起神經(jīng)細(xì)胞由氧化應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡。神經(jīng)細(xì)胞異常過(guò)度的凋亡，必將引起神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的改變，引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用。因此，細(xì)胞凋亡是PBDEs引起神經(jīng)毒性作用的關(guān)鍵因素之一。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路是細(xì)胞凋亡三條經(jīng)典途徑之一。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)的正確折疊、組裝和運(yùn)輸?shù)膱?chǎng)所。當(dāng)細(xì)胞受到體內(nèi)外不同強(qiáng)度刺激，如氧化應(yīng)激后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)將產(chǎn)生未折疊蛋白/錯(cuò)誤折疊蛋白積聚，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生不同程度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）,激活未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）的信號(hào)通路。持續(xù)或過(guò)強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境的紊亂，從而通過(guò)UPR信號(hào)通路活化相關(guān)分子而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 目前尚未見(jiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR信號(hào)通路參與PBDEs致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的文獻(xiàn)報(bào)道。但新近研究發(fā)現(xiàn)，PBDEs染毒大鼠海馬神經(jīng)元的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)病理性改變；PBDEs的代謝產(chǎn)物可使染毒細(xì)胞UPR信號(hào)通路相關(guān)基因如葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein78，GRP78）、生長(zhǎng)抑制和DNA損傷誘導(dǎo)家族基因153（GADD153/C/EBP homologous protein，CHOP）、GADD34及X盒結(jié)合蛋白1（X-box-binding protein-1，XBP1）的表達(dá)發(fā)生改變。根據(jù)目前相關(guān)研究結(jié)果所提供的初步線索，推測(cè)PBDEs可能通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR信號(hào)通路導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡從而引起神經(jīng)毒性。 基于上述理由，本課題利用在環(huán)境樣本和人體組織中含量最高、對(duì)生物和人體毒性作用最強(qiáng)的PBDEs同系物之一的2，2’，4，4’-四溴聯(lián)苯醚（PBDE-47）作為目標(biāo)受試物，將體外培養(yǎng)的具有神經(jīng)細(xì)胞特性的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y細(xì)胞）作為受試細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。采用流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）、實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time fluorescent quantitation reverse transcriptasepolymerase chain reaction，real time RT-PCR）、western blot和Hoechst33258細(xì)胞核染色等技術(shù)和方法，檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞ROS產(chǎn)生、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)細(xì)胞GRP78、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜感應(yīng)蛋白IRE1（inositol-requiring enzyme1）、XBP1、c-jun N末端激酶（c-junN-terminal kinase，JNK）和CHOP等基因mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，并通過(guò)小分子干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）沉默IRE1后檢測(cè)細(xì)胞凋亡、UPR通路相關(guān)分子的mRNA和蛋白表達(dá)的變化，探討ERS與UPR細(xì)胞凋亡通路是否參與了PBDE-47致神經(jīng)細(xì)胞的毒性效應(yīng)，明確IRE1通路在PBDE-47產(chǎn)生的神經(jīng)毒性中的作用。以期在PBDE-47致神經(jīng)毒作用的分子機(jī)制研究方面獲得新的進(jìn)展，為PBDEs對(duì)機(jī)體危害作用的預(yù)防控制提供基礎(chǔ)資料和理論依據(jù)，具有重要的理論和實(shí)際意義。 第一部分PBDE-47對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷并誘導(dǎo)UPR及激活I(lǐng)RE1信號(hào)通路 目的：明確PBDE-47是否通過(guò)誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生ERS和UPR而產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，為研究PBDE-47的神經(jīng)毒性作用機(jī)制提供線索。 方法：SH-SY5Y細(xì)胞暴露于不同濃度的PBDE-47（0，1，5，10μmol/L），，在不同時(shí)間點(diǎn)（3，6，12，24h），應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其ROS產(chǎn)生水平；應(yīng)用real time RT-PCR技術(shù)和western blot技術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GRP78、IRE1、CHOP、JNK、磷酸化JNK（phosphor-JNK，p-JNK）、Bcl-2以及Bax等UPR中IRE1通路相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：與對(duì)照組相比，一定劑量的PBDE-47在3-24h內(nèi)使SH-SY5Y細(xì)胞ROS產(chǎn)生明顯增加（P 0.05）并具有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系、GRP78和IRE1mRNA表達(dá)水平明顯升高（P 0.05）并具有劑量-效應(yīng)關(guān)系；用10μmol/L的PBDE-47處理SH-SY5Y細(xì)胞24h后IRE1和CHOP的蛋白表達(dá)水平均明顯高于0，3，6和12h的表達(dá)水平（P 0.05）；不同濃度的PBDE-47處理SH-SY5Y細(xì)胞24h后，IRE1、CHOP和p-JNK蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高（P 0.05），并具有濃度依賴性關(guān)系，Bcl-2蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯下降（P 0.05），Bax/Bcl-2比值較對(duì)照組顯著增加（p 0.01）。 結(jié)論：PBDE-47可能通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生而引起細(xì)胞氧化應(yīng)激，并導(dǎo)致ERS發(fā)生和激活UPR，通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路（氧化應(yīng)激介導(dǎo)的ERS和UPR）對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用。UPR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的IRE1通路參與了PBDE-47所致的神經(jīng)毒性作用。 第二部分IRE1信號(hào)通路在PBDE-47致SH-SY5Y細(xì)胞毒性中的作用及其機(jī)制研究 目的：由于IRE1是UPR中對(duì)細(xì)胞存活與死亡起決定意義的跨膜感應(yīng)蛋白，IRE1具有重要的細(xì)胞凋亡調(diào)控作用，因此本研究旨在探討IRE1細(xì)胞凋亡通路在PBDE-47致SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)毒性中的作用。 方法：應(yīng)用siRNA技術(shù)將SH-SY5Y細(xì)胞IRE1基因沉默后再暴露于10μmol/LPBDE-4724h，利用光鏡和倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)以及經(jīng)Hoechst核染色的細(xì)胞核形態(tài)；利用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡，使用real time RT-PCR技術(shù)和western blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GRP78、IRE1、非剪切形式XBP1-XBP1u、剪切形式XBP1-XBP1s、CHOP、JNK、p-JNK、Bcl-2以及Bax等UPR中IRE1通路凋亡相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：PBDE-47引起SH-SY5Y細(xì)胞體積收縮、呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)變化，活細(xì)胞數(shù)量減少；核染色質(zhì)呈現(xiàn)濃積、片斷化、核破裂和細(xì)胞空泡樣等改變，并可見(jiàn)凋亡小體。沉默IRE1基因后，PBDE-47引起細(xì)胞的凋亡性形態(tài)改變明顯增加（P 0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PBDE-47可顯著增加細(xì)胞凋亡率（P 0.05），沉默IRE1基因后PBDE-47引起的細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增加（P 0.05）。與對(duì)照組相比，PBDE-47顯著升高XBP1u、XBP1s、CHOP、JNK和Bax的mRNA表達(dá)水平（P 0.05或P 0.01），明顯降低Bcl-2的mRNA表達(dá)水平（P 0.05）；與陰性對(duì)照+PBDE-47組相比，沉默IRE1基因后，用PBDE-47處理的細(xì)胞XBP1s、CHOP、JNK和Bcl-2mRNA表達(dá)水平顯著下降（P 0.05或P 0.01），但Bax mRNA表達(dá)水平卻顯著升高（P 0.05），Bax/Bcl-2比值明顯增加（P 0.05）。與陰性對(duì)照+PBDE-47組相比，沉默IRE1基因后，用PBDE-47處理的細(xì)胞CHOP、JNK和Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)（P 0.05），但Bax蛋白水平顯著上升（P 0.05），Bax/Bcl-2比值均明顯增加（P 0.01）。 結(jié)論：IRE1通過(guò)上調(diào)XBP1s、JNK和CHOP的表達(dá)激活相關(guān)細(xì)胞信號(hào)通路，從而對(duì)細(xì)胞具有抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的雙重作用；Bcl-2表達(dá)水平下調(diào)和Bax表達(dá)水平上升，Bax/Bcl-2比值顯著升高是沉默IRE1后PBDE-47引起SH-SY5Y細(xì)胞凋亡增加的重要原因。在24h，IRE1對(duì)PBDE-47引起的SH-SY5Y細(xì)胞毒性作用以保護(hù)性作用為主導(dǎo)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R114

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 王宇;劉耀華;趙世光;;XBP1在腫瘤中作用的研究進(jìn)展[J];中華腫瘤防治雜志;2012年10期

2 孫文霞;黃才國(guó);;腫瘤多藥耐藥:機(jī)制及逆轉(zhuǎn)劑[J];生命的化學(xué);2012年05期

3 彭少卿;安利國(guó);張珍;袁金鐸;楊桂文;;鯉魚Xbp1基因克隆與組織特異性表達(dá)分析[J];濟(jì)南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2013年02期

4 張凱強(qiáng);張穎;劉璐;顧何鋒;馬林;;氟對(duì)大鼠切牙成釉細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子表達(dá)的影響[J];上�？谇会t(yī)學(xué);2013年05期

5 牛曉閣;汪森明;丁為民;范子榮;張積仁;;Apogossypolone抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[J];腫瘤;2010年12期

6 王松;;吡咯列酮對(duì)糖尿病大鼠心臟缺血再灌注的保護(hù)作用及機(jī)制[J];毒理學(xué)雜志;2014年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 魏寧;新型漢防己甲素衍生物H1抗耐藥作用研究及無(wú)毒濃度H1對(duì)P-gp表達(dá)與功能的影響[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

2 劉小東;漢防己甲素衍生物W6和W18逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥及BrTet增強(qiáng)Bel7402細(xì)胞凋亡敏感性的作用機(jī)制研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前8條

1 孫巖;變構(gòu)菌素誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡機(jī)制的研究[D];大連理工大學(xué);2011年

2 牛曉閣;ApoG2誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡及自體吞噬的機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2011年

3 鄭國(guó)沛;5-Fu誘導(dǎo)的乳腺癌多藥耐藥細(xì)胞系的建立及耐藥機(jī)制研究[D];中南大學(xué);2010年

4 楊敏;MK-ASODN增強(qiáng)絨毛膜癌細(xì)胞對(duì)5-FU化療敏感性的研究[D];中南大學(xué);2012年

5 魏芳;ApoG2對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞放射增敏作用及與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用協(xié)同效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

6 盧微;紫草素誘導(dǎo)MCF-7乳腺癌細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究[D];吉林大學(xué);2013年

7 陳吉?jiǎng)?內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激上調(diào)SET7/9表達(dá)機(jī)制及其在糖尿病腎病中的作用[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2013年

8 鐘梅;Apogossypolone聯(lián)合紫杉醇對(duì)人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2431731