【摘要】：目的本研究通過觀察不同濃度和時間的氟處理對體外培養(yǎng)的原代海馬神經元突觸形態(tài)、超微結構的影響,檢測突觸可塑性相關分子的基因和蛋白表達水平,明確氟暴露對海馬神經元突觸結構可塑性影響。方法取新生24h內的SPF級SD大鼠的海馬組織,經消化后進行體外培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后將海馬神經元分別暴露在含有終濃度為0.0(對照)、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg/L氟化鈉的培養(yǎng)基中,置入含有5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h、12h、24h。光學倒置顯微鏡及透射電子顯微鏡下觀察氟處理后海馬神經元突觸及其胞體的形態(tài)變化;CCK8測定氟處理后海馬神經元細胞存活率;一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)試劑盒測定細胞培養(yǎng)上清液中NOS活力和NO含量;流式細胞儀測定細胞中鈣離子水平;RT-PCR法測定細胞中突觸相關蛋白突觸素(SYN)、生長相關蛋白43(GAP-43)、突觸后致密蛋白95(PSD-95)的m RNA表達水平;Western-blot法測定細胞中磷酸化鈣調蛋白激酶Ⅱ(p Ca MKⅡ)、SYN、GAP-43、PSD-95蛋白的表達水平。結果1隨著氟處理濃度增加,具有豐富型神經網絡細胞的個數減少,而具有非豐富型神經網絡細胞的個數增加。電鏡下可觀察到氟處理6h的海馬神經元線粒體有明顯的空泡化,且隨著氟處理劑量的增加線粒體空泡現象愈明顯。2細胞存活率在不同濃度氟處理組間有統(tǒng)計學差異(P0.05),0.4、0.8、1.6mg/L各組細胞的存活率低于對照組和低劑量(0.1、0.2mg/L)組(P0.05);細胞存活率在不同時間氟處理組間有統(tǒng)計學意義(P0.05),0.4、0.8和1.6mg/L各組氟處理24h的細胞存活率顯著低于6h(P0.05),處理時間和處理劑量對細胞存活率的影響存在交互作用(P0.05)。3細胞內鈣離子水平及p Ca MKⅡ蛋白表達水平在不同濃度氟處理組間有統(tǒng)計學差異(P0.05),0.2、0.4、0.8、1.6 mg/L各組細胞內鈣離子水平及p Ca MKⅡ蛋白表達水平顯著高于對照組(P0.05),隨著氟處理劑量增加細胞內鈣離子水平及p Ca MKⅡ蛋白表達水平呈升高趨勢;細胞內鈣離子水平及p Ca MKⅡ蛋白表達水平在不同時間氟處理組間有統(tǒng)計學差異(P0.05),0.2、0.4、0.8、1.6mg/L氟處理24h各組鈣離子水平顯著高于6h和12h的表達水平(P0.05),氟處理12h和24h的p Ca MKⅡ蛋白表達水平顯著高于6h的表達水平(P0.05)。氟處理時間和劑量對鈣離子水平及p Ca MKⅡ蛋白表達水平的影響存在交互作用(P0.05)。4培養(yǎng)上清液中NOS活力及NO含量在不同濃度氟處理組間有統(tǒng)計學差異(P0.05),0.4、0.8、1.6mg/L氟處理各組NOS活力及NO含量顯著高于對照組和低劑量(0.1、0.2mg/L)組(P0.05);培養(yǎng)上清液中NOS活力及NO含量在不同時間氟處理組間有統(tǒng)計學差異(P0.05),0.4、0.8、1.6mg/L氟處理24h各組NOS活力及NO含量顯著高于6h的表達水平(P0.05),0.4、0.8、1.6mg/L氟處理24h各組NO含量顯著高于12h(P0.05)。氟處理時間和劑量對NOS活力及NO含量的影響存在交互作用(P0.05)。5 SYN、GAP-43、PSD-95 m RNA表達水平在不同濃度氟處理組間有統(tǒng)計學差異(P0.05),0.4、0.8、1.6mg/L氟處理各組細胞內SYN、GAP-43、PSD-95 m RNA表達水平顯著低于對照組和低劑量(0.1、0.2mg/L)組(P0.05),呈降低趨勢;SYN、GAP-43、PSD-95 m RNA表達水平在不同時間氟處理組間有統(tǒng)計學差異(P0.05)。0.4、0.8、1.6mg/L氟處理24h各組SYN、GAP-43、PSD-95 m RNA表達水平顯著低于氟處理6h和12h各組的表達水平(P0.05),0.4、0.8、1.6mg/L氟處理12h的GAP-43 m RNA表達水平顯著低于6h(P0.05)。氟處理時間和劑量對SYN、GAP-43、PSD-95 m RNA表達水平的影響存在交互作用(P0.05)。6 SYN、GAP-43、PSD-95蛋白表達水平在不同濃度氟處理組間有統(tǒng)計學差異(P0.05),0.4、0.8、1.6 mg/L氟處理各組細胞內SYN、GAP-43、PSD-95蛋白表達水平顯著高于對照組和低劑量(0.1、0.2mg/L)組(P0.05),呈降低趨勢;SYN、GAP-43、PSD-95蛋白表達水平在不同時間氟處理組間有統(tǒng)計學差異(P0.05),0.4、0.8、1.6mg/L氟處理24h的SYN,GAP-43和PSD-95蛋白水平顯著低于6h和12h(P0.05)。結論1氟降低體外培養(yǎng)的海馬神經元存活率和具有豐富型神經網絡細胞的構成比;氟處理損傷海馬神經元的線粒體結構。2氟使體外培養(yǎng)的海馬神經元鈣超載,p Ca MKⅡ蛋白表達水平升高;氟增強NOS的活力,升高NO水平,造成海馬神經元損傷;通過降低SYN、GAP-43、PSD-95 m RNA和蛋白的表達水平而損傷其突觸結構可塑性。3氟處理濃度和時間均能對海馬神經元的突觸結構可塑性造成損傷,且兩者之間存在著交互作用。
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【學位授予單位】：華北理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R114

【參考文獻】

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本文編號：2429842