【摘要】：雙酚A(bisphenol A,BPA)廣泛存在于人類生存環(huán)境中，與人的各種生產(chǎn)、生活活動(dòng)密切相關(guān)，人體普遍暴露于雙酚A中，尤其是孕婦的暴露日益受到關(guān)注。經(jīng)典的毒理學(xué)研究指出一定劑量的BPA可能抑制胚胎發(fā)育。19世紀(jì)末以前，因受實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段和醫(yī)學(xué)倫理學(xué)方面的限制，難以開展早期胚胎發(fā)育宮內(nèi)研究，這使人們對BPA對胎兒早期發(fā)育的影響及其機(jī)制知之甚少，且主要停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段。20世紀(jì)末以來，胚胎干細(xì)胞理論和技術(shù)及其應(yīng)用的快速發(fā)展，為外源化學(xué)物的毒性研究提供了新的手段。本研究選用雙酚A作用于小鼠胚胎干細(xì)胞（mouse embryonic stem cell，mESC）并開展系列相關(guān)的體外實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞水平評價(jià)雙酚A的胚胎毒性，為合理評價(jià)BPA的安全性提供科學(xué)依據(jù)；同時(shí)觀察BPA是否可以通過改變部分基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平進(jìn)而影響特定基因的表達(dá)，為進(jìn)一步研究BPA的早期胚胎發(fā)育影響及其機(jī)制提供新思路。 目的：1、通過體外飼養(yǎng)層支持培養(yǎng)S6系小鼠胚胎干細(xì)胞，應(yīng)用胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法（EST）評價(jià)BPA的胚胎毒性，同時(shí)觀察不同濃度BPA對擬胚體生長分化的影響，為合理評價(jià)BPA的安全性及探索雙酚A對小鼠胚胎干細(xì)胞分化潛能的影響提供依據(jù)。2、mES細(xì)胞采用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察不同濃度BPA對其細(xì)胞毒性及OCT4、SOX2及Nanog基因表達(dá)水平的影響，同時(shí)檢測BPA對mES細(xì)胞OCT4基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化情況，為進(jìn)一步研究BPA的早期胚胎發(fā)育影響及其機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。 方法：1、采用飼養(yǎng)層支持培養(yǎng)mES細(xì)胞，設(shè)置溶劑對照（DMSO）、BPA（10~(-7)mol/L、10~(-6)mol/L、10~(-5)mol/L、10~(-4)mol/L、10~(-3)mol/L，所用BPA濃度涵蓋了環(huán)境相關(guān)濃度和較高濃度對照）。利用懸滴、懸浮培養(yǎng)方法，通過對不同濃度BPA作用下，mES細(xì)胞體外分化為心肌細(xì)胞能力的檢測，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，結(jié)合相應(yīng)CCK-8法檢測BPA對mES細(xì)胞及小鼠胚胎成纖維細(xì)胞3T3的半數(shù)抑制濃度（IC50）,通過分化抑制試驗(yàn)得到雙酚A對小鼠胚胎干細(xì)胞的50%分化抑制濃度（ID50），再根據(jù)判別公式評價(jià)雙酚A的胚胎毒性，并篩選合適的濃度用于后期分化誘導(dǎo)。2、結(jié)合ES細(xì)胞半數(shù)分化抑制濃度和相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)置溶劑對照（DMSO）、BPA（10-9mol/L、10~(-8)mol/L、10~(-7)mol/L、10~(-6)mol/L）和E210-9mol/L雌二醇對照組。將mES細(xì)胞通過懸滴、懸浮培養(yǎng)方法獲得擬胚體(EB),并在不添加任何誘導(dǎo)因子的體系中連續(xù)培養(yǎng)EB至10d，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-Q-PCR)法檢測內(nèi)胚層特征性基因（Transthyretin、AFP）、中胚層特征性基因（Flk-1、Gata-1）、外胚層特征性基因（Vimentin、Nestin）在EB中的mRNA表達(dá)情況,觀察雙酚A對擬胚體生長分化的影響。3、設(shè)置溶劑對照（DMSO）、BPA（1.56×10~(-5)mol/L、3.12×10~(-5)mol/L、6.25×10~(-5)mol/L、1.25×10~(-4)mol/L、2.5×10~(-4)mol/L、5×10~(-4)mol/L、1×10~(-3)mol/L、2×10~(-3)mol/L等8個(gè)濃度組，染毒mES細(xì)胞24h后，CCK~(-8)法檢測BPA對細(xì)胞增殖的影響，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC_(50)）。然后選擇mES細(xì)胞暴露不同濃度BPA(0、10~(-8)mol/L、10~(-7)mol/L、10~(-6)mol/L、10~(-5)mol/L、10~(-4)mol/L)24h，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot技術(shù)檢測雙酚A作用下OCT4、SOX2在mRNA和蛋白水平表達(dá)的變化。4、結(jié)合堿基特異性酶切反應(yīng)與MALDI-TOF-MS檢測原理，運(yùn)用Sequenom公司的MassARRAY檢測系統(tǒng)，檢測OCT4基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化情況。 結(jié)果：1、按照胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法，得到其三個(gè)反應(yīng)終點(diǎn)IC_(50)ES、IC_(50)3T3、ID50分別為：5.22×10~(-4)mol/L，6.25×10~(-4)mol/L、7×10~(-7)mol/L，同時(shí)將三者帶入到預(yù)測模型的三個(gè)線性判別函數(shù)中，根據(jù)模型判斷標(biāo)準(zhǔn)，判斷BPA屬于強(qiáng)胚胎毒性化合物。2、在一定濃度范圍內(nèi)，BPA對內(nèi)胚層特征性基因（Transthyretin、AFP）及外胚層特征性基因（Vimentin、Nestin）的影響不明顯（P＞0.05）；而對中胚層特征性基因（Flk-1、Gata-1）影響，表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，在較低濃度組10-9mol/L及10~(-8)mol/L升高（P0.05），在較高濃度組和陽性對照組降低。3、BPA對mESC有一定的毒性作用，染毒濃度越大，細(xì)胞活性越小，二者呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，并通過計(jì)算得出BPA對mESC的IC_(50)為4.3×10~(-4)mol/L，同時(shí)結(jié)合BPA的環(huán)境相關(guān)暴露濃度和相關(guān)資料，最終取10~(-8)、10~(-7)、10~(-6)、10~(-5)、10~(-4)mol/L五個(gè)濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度；BPA處理24h后，mESC細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，較高濃度組與對照組比較，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)少許漂浮的細(xì)胞，克隆變得不規(guī)則，分化趨勢明顯。BPA濃度為10~(-7)mol/L組、10~(-6)mol/L組、10~(-5)mol/L組、10~(-4)mol/L組的OCT4mRNA相對表達(dá)水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均0.05）；BPA濃度為10~(-4)mol/L組的SOX2mRNA相對表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值0.05）；BPA濃度為10~(-6)mol/L、10~(-5)mol/L、10~(-4)mol/L濃度組Nanog的mRNA表達(dá)水平低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。BPA濃度為10~(-5)mol/L組、10~(-4)mol/L組的OCT4蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平均高于DMSO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均0.05）；而各濃度組SOX2蛋白相對表達(dá)水平均未發(fā)現(xiàn)明顯改變；而Nanog蛋白相對表達(dá)水平呈先升高后下降的趨勢，在10~(-7)mol/L達(dá)到最高，而在10~(-4)mol/L達(dá)到最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.05）。4、經(jīng)SssI甲基轉(zhuǎn)移酶處理的DNA樣品， CpG甲基化程度明顯高于其他任何一組的DNA樣品，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），提示該檢測方法的靈敏度良好。與溶劑對照組比較，DAC和TSA處理組OCT4基因CpG甲基化率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；與溶劑對照組比較，BPA處理組CpG甲基化率，隨著染毒劑量的升高有下降的趨勢，，但變化不是很明顯，僅在10~(-5)mol/L濃度組下降較為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。結(jié)論：1、成功分離培養(yǎng)了C57/BL6系小鼠來源的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，并可進(jìn)行7代以內(nèi)的傳代培養(yǎng)，成功對mES細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。初步建立小鼠EST體系，并利用該體系對BPA的胚胎毒性進(jìn)行分類，判斷BPA屬于強(qiáng)胚胎毒性化合物。2、成功將mES細(xì)胞分化成擬胚體，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著BPA染毒濃度的升高，擬胚體中胚層特征性基因表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，提示在較低濃度范圍內(nèi)的BPA對mES細(xì)胞的分化潛能有影響，尤其對分化為中胚層細(xì)胞影響較大，促進(jìn)其向中胚層分化。3、BPA在一定濃度范圍內(nèi)可增強(qiáng)OCT4基因的表達(dá)，對SOX2基因表達(dá)無明顯影響，而在一定程度上降低Nanog基因的表達(dá)，提示OCT4、SOX2及Nanog基因協(xié)調(diào)合作，共同維持維持ES細(xì)胞多潛能性和自我更新能力及早期胚胎發(fā)育。4、BPA作用于mES細(xì)胞過程中，OCT4基因啟動(dòng)子區(qū)呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)，且其甲基化情況在低濃度時(shí)變化不明顯，只有在較高濃度時(shí)甲基化率降低。
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【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R114

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 裴新榮,李勇,龍鼎新,陳星,高麗芳,陳祥貴;雙酚A對小鼠早期胚胎發(fā)育毒性的體外實(shí)驗(yàn)研究[J];中國生育健康雜志;2003年01期

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本文編號：2427583