【摘要】：目的鄰苯二甲酸酯(phthalic acid esters,PAEs)是工業(yè)上常用的塑化劑,廣泛地存在于我們?nèi)粘Ｉ畹母鞣N商品中。PAEs會(huì)對(duì)機(jī)體的內(nèi)分泌系統(tǒng)、心、肝、肺、腎及生殖系統(tǒng)等多種組織系統(tǒng)產(chǎn)生慢性毒性作用,存在一定的危險(xiǎn)性。鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)是 PAEs 中使用最為廣泛的一種化合物,而鄰苯二甲酸單乙基己基酯(mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP)是DEHP在機(jī)體內(nèi)的代謝活化產(chǎn)物,其毒性較DEHP更強(qiáng)。胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cell,ESC)是一種能夠無限增殖、自我更新、可分化為機(jī)體各種細(xì)胞的多能性細(xì)胞,因其對(duì)受試物有較好的靈敏性,是近年來常用的體外替代實(shí)驗(yàn)對(duì)象。為了探究MEHP的毒性作用,本研究就MEHP對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞的多能性維持的影響及其可能的機(jī)制進(jìn)行研究,進(jìn)而為胚胎早期發(fā)育的影響因素及相關(guān)機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。方法1.細(xì)胞培養(yǎng):用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(輻照后)(Mouse Embryonic Fibroblast,MEF)支持培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞(mouse Embryonic Stem Cell,mESC),于 37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔天換液,5～7天可傳代一次。用堿性磷酸酶染色法檢測(cè)mESCs是否分化,被染成藍(lán)紫色的mESCs表示細(xì)胞未出現(xiàn)分化,說明該批次細(xì)胞可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.受試物的配制:稱取MEHP溶于DMSO中,濾菌后,用mESCs培養(yǎng)液配制含0.1%DMSO的對(duì)照溶劑組及0.1、1、10、100、1000μmol/LMEHP的不同染毒劑量組。3.mESCs細(xì)胞形態(tài)觀察:用含有不同濃度受試物的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞,在鏡下觀察MEHP對(duì)mESCs細(xì)胞形態(tài)的影響。4.細(xì)胞毒性檢測(cè):用含有不同濃度受試物的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞,將MEHP處理后的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)(CCK8法)和細(xì)胞凋亡檢測(cè)(流式細(xì)胞術(shù)),分析MEHP對(duì)mESCs的細(xì)胞毒性。5.堿性酸酶活性檢測(cè):將MEHP處理后的細(xì)胞用堿性磷酸酶染色液進(jìn)行染色,分析MEHP對(duì)mESCs多能性維持的影響。6.基因表達(dá)水平檢測(cè):將MEHP處理后的細(xì)胞,提取總RNA后,反轉(zhuǎn)錄生成cDNA,以Real-time PCR法檢測(cè)多能性維持標(biāo)記物SOX 2、OCT 4基因表達(dá)水平的變化。7.蛋白表達(dá)水平檢測(cè):將MEHP處理后的細(xì)胞分別用免疫熒光法和Western-blot法檢測(cè)SOX 2、OCT 4蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果1.細(xì)胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),隨著染毒劑量的增加,mESCs的克隆細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量出現(xiàn)降低,細(xì)胞團(tuán)的大小也有減少,在高劑量組(1OOOμmol/L)中效果尤為明顯。2.細(xì)胞活力檢測(cè)發(fā)現(xiàn),高劑量組(1000μmol/L)的mESCs細(xì)胞活力顯著降低(P0.05),其它劑量的細(xì)胞活力也出現(xiàn)降低趨勢(shì),但效果不顯著。3.細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn),高劑量(1OO0μmol/L)MEHP可增加mESCs總細(xì)胞凋亡率(P0.05),其他劑量組隨著染毒劑量的增加,凋亡率呈增加趨勢(shì),但與對(duì)照組比較效果并不顯著(P0.05);而對(duì)于其他的細(xì)胞凋亡指標(biāo),如活細(xì)胞比率、早期細(xì)胞凋亡率、晚期細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞碎片比率,各劑量組間均未出現(xiàn)顯著性差異(P0.05)。4.堿性磷酸酶染色發(fā)現(xiàn),對(duì)照組和低劑量組的mESCs均被染成深藍(lán)色或藍(lán)紫色,而高劑量(1000μmol/L)的mESCs著色較淺,甚至未著色。5.對(duì)mESCs全能性標(biāo)記物SOX 2、OCT 4進(jìn)行基因蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在100μmol/L、100μmol/L劑量組中,SOX 2、OCT 4基因表達(dá)均出現(xiàn)顯著降低(P0.05)。6.蛋白檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),SOX2、OCT4蛋白結(jié)果與基因結(jié)果相似,發(fā)現(xiàn)SOX 2和OCT 4蛋白表達(dá)在100μmol/L時(shí)其表達(dá)量出現(xiàn)降低,但不顯著,而在1000μmol/L劑量時(shí)其表達(dá)量出現(xiàn)了顯著降低(P0.05)。結(jié)論1.MEHP能夠影響mESCs的形態(tài),降低mESCs的細(xì)胞活力,并增加總的細(xì)胞凋亡率,因此,一定劑量的MEHP對(duì)mESCs存在細(xì)胞毒作用,能夠抑制mESCs的正常生長(zhǎng)。2.MEHP能夠減少了堿性磷酸酶的合成降低mESCs多能性標(biāo)記物SOX 2和OCT4的基因和蛋白表達(dá)水平,影響mESCs的多能性維持,致使其向著非正常的方向分化,進(jìn)而影響到胚胎早期發(fā)育。
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【學(xué)位授予單位】：沈陽醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2417046