發(fā)布時間：2019-01-28 12:07

【摘要】：目的鄰苯二甲酸酯(phthalic acid esters,PAEs)是工業(yè)上常用的塑化劑,廣泛地存在于我們日常生活的各種商品中。PAEs會對機體的內分泌系統(tǒng)、心、肝、肺、腎及生殖系統(tǒng)等多種組織系統(tǒng)產(chǎn)生慢性毒性作用,存在一定的危險性。鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)是 PAEs 中使用最為廣泛的一種化合物,而鄰苯二甲酸單乙基己基酯(mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP)是DEHP在機體內的代謝活化產(chǎn)物,其毒性較DEHP更強。胚胎干細胞(Embryonic Stem Cell,ESC)是一種能夠無限增殖、自我更新、可分化為機體各種細胞的多能性細胞,因其對受試物有較好的靈敏性,是近年來常用的體外替代實驗對象。為了探究MEHP的毒性作用,本研究就MEHP對小鼠胚胎干細胞的多能性維持的影響及其可能的機制進行研究,進而為胚胎早期發(fā)育的影響因素及相關機制的研究提供理論依據(jù)。方法1.細胞培養(yǎng):用小鼠胚胎成纖維細胞(輻照后)(Mouse Embryonic Fibroblast,MEF)支持培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞(mouse Embryonic Stem Cell,mESC),于 37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔天換液,5～7天可傳代一次。用堿性磷酸酶染色法檢測mESCs是否分化,被染成藍紫色的mESCs表示細胞未出現(xiàn)分化,說明該批次細胞可用于后續(xù)實驗。2.受試物的配制:稱取MEHP溶于DMSO中,濾菌后,用mESCs培養(yǎng)液配制含0.1%DMSO的對照溶劑組及0.1、1、10、100、1000μmol/LMEHP的不同染毒劑量組。3.mESCs細胞形態(tài)觀察:用含有不同濃度受試物的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞,在鏡下觀察MEHP對mESCs細胞形態(tài)的影響。4.細胞毒性檢測:用含有不同濃度受試物的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞,將MEHP處理后的細胞進行細胞活力檢測(CCK8法)和細胞凋亡檢測(流式細胞術),分析MEHP對mESCs的細胞毒性。5.堿性酸酶活性檢測:將MEHP處理后的細胞用堿性磷酸酶染色液進行染色,分析MEHP對mESCs多能性維持的影響。6.基因表達水平檢測:將MEHP處理后的細胞,提取總RNA后,反轉錄生成cDNA,以Real-time PCR法檢測多能性維持標記物SOX 2、OCT 4基因表達水平的變化。7.蛋白表達水平檢測:將MEHP處理后的細胞分別用免疫熒光法和Western-blot法檢測SOX 2、OCT 4蛋白表達水平的變化。結果1.細胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),隨著染毒劑量的增加,mESCs的克隆細胞團的數(shù)量出現(xiàn)降低,細胞團的大小也有減少,在高劑量組(1OOOμmol/L)中效果尤為明顯。2.細胞活力檢測發(fā)現(xiàn),高劑量組(1000μmol/L)的mESCs細胞活力顯著降低(P0.05),其它劑量的細胞活力也出現(xiàn)降低趨勢,但效果不顯著。3.細胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn),高劑量(1OO0μmol/L)MEHP可增加mESCs總細胞凋亡率(P0.05),其他劑量組隨著染毒劑量的增加,凋亡率呈增加趨勢,但與對照組比較效果并不顯著(P0.05);而對于其他的細胞凋亡指標,如活細胞比率、早期細胞凋亡率、晚期細胞凋亡率、細胞碎片比率,各劑量組間均未出現(xiàn)顯著性差異(P0.05)。4.堿性磷酸酶染色發(fā)現(xiàn),對照組和低劑量組的mESCs均被染成深藍色或藍紫色,而高劑量(1000μmol/L)的mESCs著色較淺,甚至未著色。5.對mESCs全能性標記物SOX 2、OCT 4進行基因蛋白檢測發(fā)現(xiàn),在100μmol/L、100μmol/L劑量組中,SOX 2、OCT 4基因表達均出現(xiàn)顯著降低(P0.05)。6.蛋白檢測結果發(fā)現(xiàn),SOX2、OCT4蛋白結果與基因結果相似,發(fā)現(xiàn)SOX 2和OCT 4蛋白表達在100μmol/L時其表達量出現(xiàn)降低,但不顯著,而在1000μmol/L劑量時其表達量出現(xiàn)了顯著降低(P0.05)。結論1.MEHP能夠影響mESCs的形態(tài),降低mESCs的細胞活力,并增加總的細胞凋亡率,因此,一定劑量的MEHP對mESCs存在細胞毒作用,能夠抑制mESCs的正常生長。2.MEHP能夠減少了堿性磷酸酶的合成降低mESCs多能性標記物SOX 2和OCT4的基因和蛋白表達水平,影響mESCs的多能性維持,致使其向著非正常的方向分化,進而影響到胚胎早期發(fā)育。
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【學位授予單位】：沈陽醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R114

【參考文獻】

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本文編號：2417046