發(fā)布時間：2019-01-17 12:27

【摘要】：【背景】隨著現(xiàn)代文明的不斷發(fā)展,重金屬鉛的環(huán)境污染問題逐漸被人們重視,并且成為世界范圍的公共安全問題。鉛中毒能夠引起人體多個器官和系統(tǒng)的功能紊亂和缺失,而目前研究最為關(guān)注的是鉛的神經(jīng)毒性,特別是鉛對發(fā)育期的神經(jīng)毒性。我們之前的研究顯示,早期鉛暴露能誘導(dǎo)鉛神經(jīng)毒性的發(fā)生,并且鉛神經(jīng)毒性的作用機制有多個方面,其中鉛暴露誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化進而引起神經(jīng)炎癥反應(yīng)是其發(fā)揮神經(jīng)毒性的重要機制之一。炎癥體這一概念自2002年提出后,便引起的廣泛的重視,炎癥體介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)在多種神經(jīng)疾病的病程和預(yù)后中發(fā)揮了極為關(guān)鍵的作用。其中研究最多的,發(fā)揮功能最明顯的是NLRP3炎癥體。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,NLRP3炎癥體主要表達在小膠質(zhì)細(xì)胞中,受到外界刺激后,NLRP3炎癥體的激活會導(dǎo)致下游Caspase-1的剪切,進而促進IL-1β的成熟和釋放。目前,NLRP3炎癥體的激活在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中得到證實,但是NLRP3在鉛誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)中是否發(fā)揮作用,尚未見報道。NLRP3的調(diào)控機制復(fù)雜,目前研究熱點主要集中在內(nèi)環(huán)境調(diào)控、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。自噬是維持細(xì)胞正常生理功能的重要機制之一,近期研究顯示小膠質(zhì)細(xì)胞自噬對NLRP3炎癥體也有調(diào)節(jié)作用;鉛暴露是否影響小膠質(zhì)細(xì)胞中的自噬功能目前尚未報道,并且自噬是否參與鉛誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)以及NLRP3炎癥體的激活過程也尚不清楚;NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)控NLRP3的活性中發(fā)揮了不可替代的作用,其是否參與鉛對NLRP3的激活也尚無定論�！灸康摹客ㄟ^建立體內(nèi)、體外鉛暴露模型,驗證鉛暴露誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化進而引起神經(jīng)炎癥反應(yīng)的現(xiàn)象;通過檢測體內(nèi)體外NLRP3的表達情況,確定鉛暴露對NLRP3炎癥體表達的影響,并通過抑制NLRP3的表達,證實NLRP3在鉛神經(jīng)毒性中的作用;從內(nèi)環(huán)境調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度探究鉛暴露誘導(dǎo)NLRP3炎癥體表達改變的作用機制,為了進一步闡明鉛神經(jīng)毒性的作用機制提供新的思路和方向�！痉椒ā�1.通過建立體內(nèi)、體外鉛暴露模型,采用免疫熒光染色,分子生物學(xué)實驗等實驗技術(shù),檢測鉛暴露對小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)影響和炎性因子的釋放情況,以及對神經(jīng)元的損傷情況;2.利用上述鉛暴露模型,檢測體內(nèi)外NLRP3炎癥體的表達情況,并且通過構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠和siRNA干擾技術(shù),利用多種實驗手段,觀察抑制NLRP3炎癥體的激活對鉛誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)的影響;3.利用活細(xì)胞觀察,免疫細(xì)胞熒光以及分子生物學(xué)實驗方法觀察小膠質(zhì)細(xì)胞自噬在鉛處理后的表達情況,利用抑制劑和干擾RNA技術(shù),檢測抑制自噬后對小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性因子的影響,并進一步檢測抑制自噬后對NLRP3炎癥體的影響及機制;4.利用分子生物學(xué)技術(shù),檢測鉛暴露對NF-κB信號通路的作用,通過加入抑制劑的方式檢測NF-κB信號通路在調(diào)控鉛誘導(dǎo)NLRP3激活中發(fā)揮的作用,并進一步確定NLRP3與自噬的相互關(guān)系�！窘Y(jié)果】1.體內(nèi)、體外鉛暴露模型結(jié)果顯示鉛暴露能誘導(dǎo)海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,從而引起神經(jīng)炎癥反應(yīng)。孕期鉛暴露動物模型結(jié)果顯示,對照組相比,染鉛組仔鼠的血鉛值顯著高于對照組,差異上有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),水迷宮結(jié)果顯示染鉛組小鼠的平臺區(qū)潛伏期時間顯著高于對照組小鼠(P0.05);染鉛組中TUNEL陽性的細(xì)胞比例顯著升高(P0.05),并且染鉛組的小膠質(zhì)細(xì)胞活化比例明顯增加(P0.05);原代小膠質(zhì)細(xì)胞和BV2細(xì)胞結(jié)果顯示,鉛暴露后CD68陽性的細(xì)胞比例明顯增加,胞體明顯增大,并且炎性因子的mRNA表達和釋放量都明顯增加(P0.05)。2.NLRP3參與鉛暴露誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。體內(nèi)結(jié)果顯示鉛暴露能顯著增加海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3的表達量,并增加Caspase-1的剪切和IL-1β的蛋白表達(P0.05);鉛、LPS刺激均能顯著增加BV2細(xì)胞中NLRP3及相關(guān)蛋白的表達;加入NLRP3-siRNA能抑制BV2細(xì)胞中NLRP3及下游分子的表達,并且能降低IL-1β的mRNA水平和釋放量(P0.05);通過NLRP3基因敲除小鼠構(gòu)建鉛暴露模型,結(jié)果顯示野生型和NLRP3敲除鼠的血鉛值沒有明顯差異(P0.05);NLRP3敲除鼠的運動能力有所改變,并且敲除NLRP3不會增加小鼠海馬區(qū)的凋亡,但能夠抑制鉛誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;敲除NLRP3不影響小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量,但影響鉛暴露后小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài);敲除NLRP3能減少體內(nèi)NLRP3的激活,并降低部分炎性因子的表達。3.自噬參與調(diào)節(jié)鉛暴露誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)及NLRP3的活化。鉛暴露后能顯著增加小膠質(zhì)細(xì)胞中LC3陽性泡的聚集,并增加多種自噬相關(guān)蛋白的表達(P0.05);3-MA或者Atg5-siRNA能顯著抑制自噬的表達,并且抑制BV2細(xì)胞中的炎性因子的mRNA表達(P0.05),降低NLRP3及下游相關(guān)蛋白的蛋白表達(P0.05)。4.NF-κB信號通路參與鉛對NLRP3炎癥體的調(diào)控。鉛暴露后能顯著增加小鼠海馬區(qū)NF-κB的磷酸化水平(P0.05);在BV2細(xì)胞中利用PDTC抑制NF-κB的磷酸化后能顯著降低鉛刺激誘導(dǎo)的NF-κB和NLRP3及下游分子的蛋白表達(P0.05);通過加入3-MA能部分抑制NF-κB的磷酸化并能顯著降低NLRP3的激活程度�！窘Y(jié)論】1.孕期鉛暴露模型結(jié)果提示鉛暴露主要導(dǎo)致小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力下降;體內(nèi)和體外實驗均證實,鉛暴露后小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)改變并且釋放多種炎性因子,提示鉛暴露誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)可能是導(dǎo)致鉛神經(jīng)毒性的重要原因。2.鉛暴露能增加體內(nèi)、體外NLRP3炎癥體的表達,并且促進Caspase-1的剪切和IL-1β的表達,而通過siRNA干擾技術(shù)和基因敲除動物實驗抑制NLRP3能顯著降低鉛誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng),提示NLRP3在鉛誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。3.鉛暴露能導(dǎo)致小膠質(zhì)中自噬相關(guān)蛋白的升高,通過抑制自噬紊亂能顯著降低鉛暴露對小膠質(zhì)細(xì)胞的活化作用,提示小膠質(zhì)細(xì)胞自噬在調(diào)節(jié)鉛暴露誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)中可能發(fā)揮重要作用。4.抑制自噬水平降低NF-κB的活化提示自噬對炎癥反應(yīng)的調(diào)控可能不僅僅通過對NLRP3的調(diào)控;抑制NF-κB信號通路能顯著降低鉛誘導(dǎo)的NLRP3的激活,提示鉛對NLRP3的調(diào)控可能通過介導(dǎo)NF-κB信號通路。綜上所述,上述研究證明了鉛暴露誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)中的相關(guān)機制,率先發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥體在鉛神經(jīng)炎癥反應(yīng)中的重要作用,揭示了自噬和NF-κB信號通路在調(diào)控鉛誘導(dǎo)的NLRP3炎癥體激活中的作用。研究結(jié)果為進一步研究鉛神經(jīng)毒性提供了新的理論依據(jù),并且為鉛毒性防護提供了思路和方向。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R114
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本文編號：2410063