【摘要】：人類自進入核時代起,就開始尋求能在核事故中起到防護作用或在放療期間保護正常組織、增加腫瘤放射敏感性的化學品。動物和人類,都暴露在天然或人為來源的電離輻射，如鐳射氣、宇宙射線以及核醫(yī)學。電離輻射對生物體構成的損傷，主要來自直接作用和間接作用，其中間接作用引起的損傷占輻射損傷的70-80%左右。這種間接作用通過輻解水產生大量的自由基進而對機體組織和器官造成損傷。這種由輻射引起的氧化應激是許多疾病的關鍵成因：如甲狀腺癌、皮膚癌、乳腺癌以及白血病等。尋找和篩選已有抗氧化劑，緩解或清除輻射所致的大量自由基，提高機體抗放能力，仍是生物醫(yī)學研究的熱點。幾類經典的輻射防護劑在動物和細胞中的防護效果及毒性都已被廣泛研究[1~2]：內源性的抗氧化劑，如超氧化物歧化酶,可被用于特定的放射治療步驟；天然抗氧化劑,如維生素E和硒,對由電離輻射誘導的損傷和死亡效果不如WR-2721和WR-151327等硫醇類化合物,但毒副作用小，治療范圍較廣；一些具有抗氧化性質的藥物單獨使用或和其它輻射修飾劑聯(lián)合使用亦可被用作輻射防護劑�？偟膩碚f，現有輻射防護藥仍然存在或是防護作用太弱，或是毒副作用太多等許多不足。 芒果苷是從知母中分離得到的多酚羥基二苯并吡喃酮類化合物，具有廣泛的生物活性:抗氧化、抗炎、抗病毒止痛以及免疫調節(jié)等特性[3~5]。有人研究表明[6]，芒果苷苷元可以減少大鼠腸道腫瘤，它可能對腸道細胞有特殊的防護敏感性；Jagetia GC教授等報道，芒果苷可提高受照小鼠的存活率并減輕外周血淋巴細胞的微核率和細胞DNA損傷[7~8]。受此啟發(fā)，我們合成了一系列芒果苷衍生物，以人腸上皮細胞和斑馬魚為輻射防護效果觀察觀察對象，希望從中篩選出一些毒性低、防護效果好，有研發(fā)前景的新化合物，并且對其作用機理進行初步探討。 研究內容: 1、芒果苷及其衍生物對細胞的輻射防護活性初篩 以細胞活力為觀察指標，研究芒果苷及衍生物對受一定劑量γ射線照射的HIEC(人腸上皮細胞)和3T3細胞的保護效應，通過細胞存活率的分析初步篩選出具有最佳輻射防護效果的化合物。 2、芒果苷類化合物濃度與輻射防護作用之間的關系 選取2種在初篩階段顯示輻射防護效果好的芒果苷類化合物（芒果苷苷元和芒果苷），分別觀察不同藥物濃度對多種照射劑量HIEC細胞的輻射防護作用，包括：①不同濃度的兩藥物對不同γ射線照射劑量下細胞存活率的影響；②不同濃度的兩藥物對不同γ射線照射劑量下細胞克隆形成率的影響；③一定濃度的兩藥物對照射后細胞凋亡率的影響。 3、芒果苷苷元對斑馬魚的輻射防護效應 以斑馬魚為整體動物模型，主要研究：①顯微注射芒果苷苷元和芒果苷對不同輻射劑量下不同發(fā)育時期的斑馬魚胚胎存活率的影響；②兩藥物對一定輻射劑量下斑馬魚胚胎孵化率和畸變率的影響；③兩藥物對一定輻射劑量下斑馬魚組織器官形態(tài)的影響。 4、芒果苷類化合物輻射防護的潛在機制研究 從自由基和DNA損傷兩方面進行初步探討：①芒果苷苷元及芒果苷清除羥自由基(·OH)的能力；②兩藥物對輻射引起的DNA雙鏈斷裂的影響，檢測其是否可減輕輻射誘導的基因毒性。 實驗方法: 1、芒果苷及所有衍生物合成制備：由第二軍醫(yī)大學藥學院有機化學教研室合成、制備和結構確認。所有化合物均溶解于DMSO中，初始濃度為10mg/mL。使用前用雙蒸水或RPMI1640培養(yǎng)基稀釋到所需濃度。 2、細胞培養(yǎng)：人腸上皮細胞（HIECs）和小鼠3T3細胞（本實驗室長期培養(yǎng)）。細胞培養(yǎng)條件：RPMI1640培養(yǎng)基（Invitrogen公司），10%胎牛牛血清（Hyclone公司），37℃，5%CO2，飽和濕氣，在細胞培養(yǎng)箱中孵育。 3、動物培養(yǎng)：成年斑馬魚為市售野生型斑馬魚（體長大于3cm），胚胎從上海長海醫(yī)院心內科實驗室獲得，按照標準操作規(guī)程飼養(yǎng)[9]。飼養(yǎng)條件：光照周期為14h/10h（晝/夜），水溫（28±1）℃。 4、γ射線照射：細胞或動物提前給予藥物預處理后，用60Co γ射線照射不同劑量，劑量率為1.0Gy/min（第二軍醫(yī)大學輻照中心）。 5、細胞活力測定：用CCK-8法和克隆形成法檢測不同處理組細胞的存活率。CCK-8法公式：細胞存活率（%）=（藥物組OD值-本底/對照組OD值-本底）×100%；克隆形成法公式：克隆形成率（%）=（克隆數/接種細胞數）/（貼壁存活細胞/接種細胞數） 6、細胞凋亡分析：流式細胞儀檢測由輻射因引起的細胞凋亡百分率的變化，Annexin V-FITC/PI雙染。 7、斑馬魚胚胎存活率測定：對不同劑量照射后斑馬魚胚胎的死亡率和一定照射劑量下孵化率、畸形率進行檢測，并觀察各實驗組不同時期胚胎發(fā)育表型變化。 8、組織病理學變化：HE染色法測定不同處理組成年斑馬魚胃腸道、肝臟和腎臟的形態(tài)變化。 9、細胞DNA檢測：用γH2AX焦點形成法檢測由輻射引發(fā)的DNA雙鏈斷裂和后續(xù)修復。奧林巴斯BX51熒光顯微鏡測定焦點形成的圖像，用image proplus軟件計數單個細胞內焦點數量。所得圖象在相同設置下對焦點個數進行分析，并用Spssl3.0統(tǒng)計軟件進行差異顯著性的分析并繪圖。 10、測定羥自由基（·OH）：用HPF熒光探針檢測芒果苷苷元和芒果苷清除輻解水產生的羥自由基。 11、統(tǒng)計學分析：所有實驗數據以x sd表示，單組間比較采用t檢驗；多組間比較采用方差分析（ANOVA），p0.05為具有統(tǒng)計學差異。 實驗結果： 1、芒果苷及其衍生物輻射防護活性篩選 1.1芒果苷衍生物輻射防護活性篩選化合物濃度選擇：HIEC細胞隨照后孵育時間延長（24、48、72h）存活率降低，照前給予不同濃度的芒果苷可提高細胞存活率。照后48h和72h檢測細胞活力，均顯示芒果苷濃度在70μg/mL時有較好的輻射防護效果，與單純照射組相比，有顯著差異（P0.01）。25個衍生物有不同程度的防護作用。 1.2芒果苷衍生物輻射防護活性篩選輻射劑量選擇：隨著照射劑量的增大（4、8、12、16Gy），單純受照的HIEC細胞存活率均出現一定程度的降低，輻射劑量為8Gy時，細胞存活率僅為33.03±0.036%。照前與芒果苷共同孵育，可顯著提高HIEC細胞存活率，與單純照射組相比具有統(tǒng)計學差異（P0.01），此防護效果在時最為顯著。 1.3芒果苷衍生物對HIEC細胞的輻射防護效果：所有芒果苷衍生物均可不同程度的提高照后HIEC細胞的存活率，提前給予芒果苷、苷元以及10號化合物后照射，檢測細胞存活率分別為：73.2±0.044%，78.3±0.029%，83.8±0.047%，與單純照射組相比顯著提高，具有統(tǒng)計學意義（P0.01）。 1.4芒果苷衍生物對3T3細胞的輻射防護效果：幾乎所有芒果苷衍生物均可不同程度的提高照后3T3細胞的存活率。單純照射3T3細胞存活率僅為40.66±0.024%，照射給予芒果苷、苷元以及21號化合物后照射，檢測細胞存活率分別為：61.6±0.038%，69.4±0.042%，64.47±0.038%，與單純照射組相比顯著提高，具有統(tǒng)計學意義（P0.01）。 2、芒果苷苷元對人腸上皮細胞的輻射生物學效應 2.1不同濃度的芒果苷苷元照射后HIEC細胞存活率的影響：輻射防護效果隨藥物濃度的增大逐漸增加，芒果苷苷元濃度為70μg/mL時，防護作用最為顯著（P0.01）。HEIC細胞在4、8、12、16Gy的照射劑量下，芒果苷苷元組存活分數是各單純照射組的1.52-，2.37-，2.41-，2.4-倍；芒果苷則為1.42-，2.22-，1.99-，1.87-倍。芒果苷苷元和芒果苷均可提高HIEC細胞照后的存活率，有較為顯著（P0.05）的防護效果，且芒果苷苷元較芒果苷作用明顯。 2.2不同濃度的芒果苷苷元對照射后HIEC細胞克隆形成率的影響：平板克隆實驗結果表明，照射前1.5h將細胞與10、20、50、70、100μg/mL的芒果苷苷元共同孵育，存活分數（SF）分別為54.4±0.061%、69.9±0.046%、81.4±0.033%、89.3±0.037%、86.3±0.060%，與單純照射（40.8±0.043%）組相比明顯提高，差異有統(tǒng)計學意義（P0.01）；芒果苷防護效果與苷元類似。 HEIC細胞在8、12、16Gy的照射劑量下，芒果苷苷元組存活分數是各單純照射組的3.12-，3.91-，4.79-倍；芒果苷為2.04-，2.35-，2.63-倍。用GraphPad Prism5.0軟件單靶多擊或多靶單擊模型擬合劑量-存活曲線，分別求得相應的劑量降低系數（DRF）：芒果苷苷元為1.833；芒果苷為1.52。以上結果提示，照射前給予芒果苷苷元或芒果苷共同孵育，可使HIEC細胞的體外增殖能力明顯提高。 2.3一定濃度芒果苷苷元對照射后HIEC細胞凋亡率的影響：流式細胞儀統(tǒng)計處理各組細胞的早期凋亡率，單獨給予芒果苷苷元或芒果苷處理的細胞早期凋亡率分別為：2.6％和3.24％，與空白對照組（2.72％）相比，差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）。因此，單純給予芒果苷苷元或芒果苷不會引起細胞凋亡的改變。4Gy單純照射組的早期凋亡率為21.42％，給予芒果苷苷元組凋亡率為7.54％，給予芒果苷組凋亡率為9.35％。照射前給予HIEC細胞芒果苷苷元或芒果苷，可顯著減輕細胞凋亡率，與單純照射組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P0.05）。 3、芒果苷苷元對斑馬魚的輻射防護效應 3.1對不同輻射劑量下不同發(fā)育時期斑馬魚胚胎存活率的影響：隨著照射劑量的增加（10Gy、20Gy、30Gy），胚胎存活率降低，具有一定的劑量-效應關系。顯微注射法給斑馬魚胚胎注射一定濃度的芒果苷苷元或芒果苷，作用一段時間后給予30Gy的γ射線照射。結果顯示：芒果苷苷元和芒果苷可以減輕γ射線對斑馬魚胚胎的致死作用。與單純照射組相比，照射前給予芒果苷苷元和芒果苷可顯著（P0.05）提高斑馬魚胚胎的存活率。 3.2對一定輻射劑量下斑馬魚胚胎孵化率和畸變率的影響：與單純照組相比，以芒果苷苷元組照射后的孵化率上升最明顯(P0.05)。γ射線照射原腸期胚胎，可造成成年斑馬魚的畸型，芒果苷苷元組畸形發(fā)生率比單純照射組明顯減少；本實驗中僅給予芒果苷苷元或芒果苷70μg/mL的胚胎孵化率下降并不明顯，但與空白對照組相比較，各組幼魚都出現一定的發(fā)育延遲現象。 3.3對一定輻射劑量下斑馬魚組織器官形態(tài)的影響：①腸道：單純照射組斑馬魚切片HE染色顯示，可看到小腸上皮細胞排列不規(guī)則，伴有不同程度的變性脫落，紋狀緣消失，部分斑馬魚腸管粘膜杯狀上皮細胞增生。照射前飼喂芒果苷苷元或芒果苷組小腸病理變化都比單純照射組輕，特別是小腸隱窩仍保持原有形態(tài)，隱窩上皮細胞數量恢復。②肝臟：經30Gy的γ射線照射后，斑馬魚的部分肝細胞出現腫脹，可見少量炎性細胞浸潤，胞漿內出現小泡性脂滴。嚴重時，表現為細胞核固縮、細胞破裂和溶解，細胞功能發(fā)生衰退和壞死。照射前飼喂芒果苷苷元和芒果苷，均可減輕輻射對斑馬魚肝臟的損傷。③腎臟：對照組斑馬魚腎臟結構完整，腎小球、腎小管清晰可見。經30Gy的γ射線照射后，斑馬魚腎小管上皮細胞出現腫脹、細胞境界不清，部分斑馬魚腎小管上皮細胞空泡樣變和脂滴，腎間質瘀血并可見灶性炎細胞浸潤。照射前飼喂芒果苷苷元和芒果苷，均可減輕輻射對斑馬魚腎臟的損傷。 4、芒果苷類化合物輻射防護作用機制探討 4.1芒果苷苷元清除羥自由基(·OH)的能力：單純照射組可以觀察到很強的HPF熒光，而在照射前于體系中加入2μg/mL芒果苷苷元即可使HPF熒光明顯減弱。定量分析時發(fā)現，與單純照射組相比，不同濃度的芒果苷苷元或芒果苷·OH含量均有明顯降低，差異具有統(tǒng)計學義（P0.05）；而且隨藥物濃度增加（1~10μg/mL），·OH含量逐漸下降，呈一定的劑量-反應關系。芒果苷苷元濃度為7μg/mL時，·OH含量下降最為明顯，芒果苷各濃度下降與苷元類似，差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）。 4.2芒果苷苷元對輻射引起的DNA雙鏈斷裂的影響：免疫熒光實驗結果表明，人腸上皮細胞照射后0.5h的γ H2AX焦點（foci）個數隨吸收劑量的增加（0~4Gy）而明顯增多，呈一定的劑量-效應關系。一定劑量照射前給予細胞芒果苷苷元70μ g/mL共同孵育，單個細胞內foci數目明顯減少，與單純照射1、2、4Gy組相比，分別減少41.3%、46.8%和43.4%，芒果苷組分別減少36.2%、40%和37.5%。僅給予HIEC芒果苷苷元或芒果苷孵育，并未改變細胞核內DSBs的數目，與空白對照組相比，無統(tǒng)計學意義（P0.05）。于照射后不同時間點檢測foci形成，照后0.5h~2h內foci數目達峰值后迅速下降，在此時間段內，芒果苷苷元組和芒果苷組的foci數目明顯減少；而照后4~8h，給藥組的foci數目與單純照射組相似，無明顯差異（P0.05）。 討論分析： 輻射損傷防治一直是生物學與醫(yī)學面臨的難題，世界很多國家已投入巨資開展輻射防護藥物的研究。但迄今為止，僅一種輻射防護藥物，即WR2721被美國FBA批準進入臨床，作為預防性保護措施在放療中應用，但是其毒副作用較大[10]，作為預防用藥很難被普通民眾接受。因此，尋求新的輻射防護劑以應用于臨床放療或防治電離輻射損傷具有重要意義。輻射造成機體的損傷是通過直接作用和間接作用兩種基本方式實現的，又以間接作用起著主要作用，也是輻射防護研究的重點。在輻射產生的間接作用中，輻射誘導的自由基又是最主要的關鍵因素，它們引發(fā)包括氧化損傷在內的一系列生物化學反應，導致細胞功能改變和結構破壞。所以清除輻射產生的自由基，削弱輻射的間接作用，達到減輕機體輻射損傷的目的，是輻射防護研究最常見的、且被眾多實驗證明是行之有效的切入途徑。 芒果苷結構中的酚羥基和芳香共軛基團的存在，使得它具有很好的清除羥自由基的能力[11]；另外，它還可以減輕自由基引發(fā)的細胞死亡，抑制線粒體功能異常的發(fā)生，修復SOD酶的活性[12~13]。芒果苷的抗氧化能力提示它可能具有很好的輻射防護效果[3~4],本課題研究證實了芒果苷的輻射防護作用。然而，芒果苷本身難溶于水，這很大程度上影響了它在輻射防護中的應用發(fā)展。通過對芒果苷母體結構的化學修飾，合成一系列新的衍生物，有可能解決芒果苷難溶于水的問題，而且還可能得到抗氧化能力更好的化合物。本課題在細胞水平上對不同芒果苷衍生物的防護作用進行研究，結果顯示，在被篩選的25個芒果苷衍生物中，許多衍生物均有不同程度的防護作用，其中芒果苷苷元的輻射防護效果最佳。利用斑馬魚作為整體動物模型進一步研究發(fā)現，芒果苷苷元可以顯著減輕γ射線對斑馬魚胚胎的致死作用，胚胎發(fā)育為成年時的畸形發(fā)生率比單純照射組明顯減少，孵化率明顯上升；成年斑馬魚照射前應用芒果苷苷元后，腸道、肝臟和腎臟組織器官形態(tài)的輻射損傷顯著減輕。這些結果充分表明，芒果苷苷元不僅保留了芒果苷具有輻射防護作用的活性，而且對細胞和整體動物的保護作用更全面。更重要的是，芒果苷苷元由于自身分子較小，具有較好的水溶性，更有研究發(fā)展前景。 芒果苷苷元的輻射防護作用，與其清除羥自由基(·OH)和保護DAN有關。本研究表明，，在1~10μg/mL濃度范圍內，隨著芒果苷苷元藥物濃度的增加，體系中·OH含量逐漸下降，呈一定的劑量-反應關系，以芒果苷苷元濃度為7μg/mL時·OH含量下降最為明顯。研究還表明，芒果苷苷元能減輕輻射引起的DNA雙鏈斷裂，一定劑量照射前給予人腸上皮細胞芒果苷苷元70μg/mL共同孵育，單個細胞內反映DNA雙鏈斷裂（DBS）情況的γH2AX foci數目明顯減少，與單純照射1、2、4Gy組相比，分別減少41.3%、46.8%和43.4%。本實驗還顯示，芒果苷也具有清除·OH和減少受照細胞γH2AX foci的活性，但作用程度略弱于芒果苷苷元。眾所周知，·OH是電離輻射誘導的對機體危害最大的自由基之一，而DNA分子則對電離輻射最敏感的生物大分子，DNA在電離輻射作用下形成的DBS，往往是細胞死亡或修復障礙的關鍵事件。我們認為，芒果苷苷元的輻射防護作用，在較大程度上是通過其清除·OH和減少DNA雙鏈斷裂途徑實現的。 綜上所述，本課題重點圍繞芒果苷苷元的輻射損傷防治作用進行探索，實驗表明照前給予芒果苷苷元可以減輕輻射對人腸上皮細胞和斑馬魚胚胎及組織的損傷，顯示了較好的對輻射損傷的治療作用。并且已有文獻報道芒果苷可用于臨床[14]，結果顯示它無明顯的急性毒性，這與本實驗結果相吻合：我們對芒果苷苷元和芒果苷的毒性進行初步分析，結果顯示它們均無明顯的急性毒性。因此，芒果苷及其衍生物在輻射損傷臨床治療應用方面具有很好的發(fā)展前景，芒果苷苷元則是一個新的潛在的輻射防護劑。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R285;R142

【參考文獻】

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本文編號：2381707