【摘要】：微生物源示蹤技術(shù)(Microbial source tracking, MST)是一種以環(huán)境微生物學(xué)、生態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)為理論依據(jù),用分子和生化的手段,分析糞便指示因子的特異性指紋圖譜,進(jìn)而確定水體中以糞便污染為主的非點(diǎn)源污染來(lái)源的新技術(shù)。它不僅能夠正確地識(shí)別受糞便污染水體的真正污染來(lái)源,還能評(píng)價(jià)各已知污染源的污染貢獻(xiàn)率,被專(zhuān)家們認(rèn)為將成為治理非點(diǎn)源糞便污染的有力工具。本課題基于REP-PCR技術(shù),對(duì)庫(kù)依賴與非庫(kù)依賴微生物源示蹤技術(shù)進(jìn)行比較與應(yīng)用。通過(guò)實(shí)踐與總結(jié),為進(jìn)一步的研究以及國(guó)家管理部門(mén)監(jiān)測(cè)與管理非點(diǎn)源糞便污染提供理論依據(jù)。 目的 采集大連與濟(jì)南糞便樣本進(jìn)行庫(kù)依賴與非庫(kù)依賴微生物源示蹤,從而比較兩種類(lèi)型微生物源示蹤技術(shù)的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性。為驗(yàn)證該方法受地理性差異的影響,采集濟(jì)南水體樣本進(jìn)行庫(kù)依賴與非庫(kù)依賴微生物源示蹤,對(duì)不同污染來(lái)源貢獻(xiàn)率進(jìn)行評(píng)價(jià),檢驗(yàn)兩種方法的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。 方法 本課題以大連和濟(jì)南為采樣點(diǎn),采用無(wú)菌操作采集雞、犬、牛、豬、人五種來(lái)源糞便樣本,以及濟(jì)南水體樣本,并選用大腸桿菌(E.coli)標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922為對(duì)照。采用伊紅美藍(lán)(EMB)鑒別試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、IMVIC試驗(yàn),對(duì)樣本中E.coli進(jìn)行分離與鑒定。采用EasyPure Genomic DNA Extraction Kit試劑盒提取DNA,并用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定OD600、OD260、OD280鑒定DNA純度。從而保證為REP-PCR (細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR)擴(kuò)增提供足夠DNA模板。采用REP-PCR技術(shù)對(duì)所提取DNA進(jìn)行擴(kuò)增,并使用凝膠圖像分析系統(tǒng)(Gel image analysis system,美國(guó)UVP公司)采集DNA指紋圖譜。采用ALPHAVIEW軟件將采集的DNA指紋圖譜轉(zhuǎn)化為數(shù)字化的DNA指紋圖譜,其中包含條帶位置、大小、相對(duì)亮度、灰度、面積等信息。采用SPSS軟件對(duì)數(shù)字化的DNA指紋圖譜進(jìn)行源示蹤,對(duì)DNA指紋圖譜進(jìn)行庫(kù)依賴與非庫(kù)依賴微生物源示蹤,比較相同地區(qū)、不同地區(qū)的不同類(lèi)型微生物源示蹤準(zhǔn)確率與平均源示蹤準(zhǔn)確率,用相同方法對(duì)所采集水樣中分離得到的E.coli樣本進(jìn)行微生物源示蹤,判斷不同宿主來(lái)源非點(diǎn)源污染的貢獻(xiàn)率。 結(jié)果 采用無(wú)菌操作取得糞便樣本共380份,其中大連210份、濟(jì)南170份。另有濟(jì)南水樣15份,經(jīng)分離、鑒定共獲得E.coli菌株1171份其中大連616份、濟(jì)南555份。經(jīng)REP-PCR基因擴(kuò)增,共獲得產(chǎn)物1171份,DNA條帶多分布于100bp至5000bp之間,其中以500bp“2000bp之間最多。同種宿主來(lái)源的樣本存在更多的共有特征條帶,不同地區(qū)同種宿主來(lái)源的樣本其特征條帶存在一定的差異,但仍可見(jiàn)共有的特征條帶。剔除重復(fù)的DNA指紋圖譜以避免偏倚,剔除后剩余DNA指紋圖譜889份,其中大連500份,濟(jì)南389份。通過(guò)ALPHAVIEW軟件將DNA指紋圖譜進(jìn)行數(shù)字化后,采用SPSS軟件進(jìn)行示蹤。 對(duì)500株大連E. coli樣本進(jìn)行庫(kù)依賴與非庫(kù)依賴源示蹤,庫(kù)依賴方法RCC分別為雞源94.9%、犬源95%、牛源99.1%、豬源94%、人源95.1%,ARCC為95.8%；非庫(kù)依賴法RCC分別為雞源67.9%、犬源74.0%、牛源65.5%、豬源66.7%、人源33.6%,ARCC為60.0%。 對(duì)389株濟(jì)南E. coli樣本進(jìn)行庫(kù)依賴與非庫(kù)依賴源示蹤,庫(kù)依賴方法RCC分別為雞源98.5%、犬源97.1%、牛源100%、豬源96.9%、人源98.3%,ARCC為98.2%；非庫(kù)依賴法RCC分別為雞源78.8%、犬源50.0%、牛源75.3%、豬源71.9%、人源62.1%,ARCC為66.8%。 對(duì)大連與濟(jì)南共889株E. coli樣本進(jìn)行庫(kù)依賴與非庫(kù)依賴源示蹤,庫(kù)依賴方法RCC分別為大連-雞源92.4%、大連-犬源90.0%、大連-牛源88.5%、大連-豬源89.3%、大連-人源85.2%、濟(jì)南-雞源87.9%、濟(jì)南-犬源92.9%、濟(jì)南-牛源97.3%、濟(jì)南-豬源97.5%和濟(jì)南-人源90.5%,ARCC為89.9%。非庫(kù)依賴法大連-雞源60.5%、大連-犬源48.0%、大連-牛源58.4%、大連-豬源12.3%、大連-人源23.8%、濟(jì)南-雞源74.7%、濟(jì)南-犬源41.4%、濟(jì)南-牛源56.2%、濟(jì)南-豬源65.6%和濟(jì)南-人源57.8%,ARCC為47.7%。 對(duì)水樣中的E.coli分別進(jìn)行庫(kù)依賴法源示蹤和非庫(kù)依賴法源示蹤,結(jié)果均表明非點(diǎn)源糞便污染主要為未知來(lái)源,貢獻(xiàn)率約為30%(非庫(kù)依賴法)到70%(庫(kù)依賴法),其次為人源,再次為雞源與犬源。 結(jié)論 本課題結(jié)果表明基于REP-PCR法的微生物源示蹤技術(shù)具有較高的可靠性,在不同類(lèi)型的源解析方法下源示蹤準(zhǔn)確率絕大多數(shù)高于60%,特別是庫(kù)依賴的源解析方法下源示蹤準(zhǔn)確率表現(xiàn)優(yōu)秀,對(duì)于同一地區(qū)樣本可達(dá)94%以上,對(duì)于不同地區(qū)樣本在85%以上。庫(kù)依賴法受到地理性差異影響小于非庫(kù)依賴法,適宜更大范圍的應(yīng)用。同時(shí)結(jié)果還表明小清河沿岸的非點(diǎn)源污染類(lèi)型除未知來(lái)源外主要為人類(lèi)糞便,其次為雞源與犬源,這一結(jié)論與當(dāng)?shù)貙?shí)際情況較為符合。本課題研究結(jié)果為下一步微生物源示蹤技術(shù)的研發(fā)以及應(yīng)用提供了參考。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R123.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 周早弘;張敏新;;防治農(nóng)業(yè)面源污染的工程技術(shù)[J];環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展;2007年06期

2 王耀兵;蘇潔;楊玉敏;蔣翰鵬;;一種糞便污染源識(shí)別新技術(shù)——微生物源示蹤[J];海洋環(huán)境科學(xué);2008年S2期

3 任學(xué)兵;湯德元;楊澤平;黃濤;徐健;王彬;;豬沙門(mén)氏菌耐藥性的研究進(jìn)展[J];豬業(yè)科學(xué);2009年12期

4 楊滴;王耀兵;李冬梅;宮強(qiáng);蘇潔;;糞便中大腸埃希菌的分離鑒定[J];微生物學(xué)雜志;2007年03期

5 馬驛;孫永學(xué);陳進(jìn)軍;陳杖榴;;獸藥殘留對(duì)生態(tài)環(huán)境影響的研究進(jìn)展[J];中國(guó)獸醫(yī)科學(xué);2010年06期

，

本文編號(hào)：2379462