【摘要】：由人糞便排入環(huán)境中的病毒已達140多種血清型,可導致胃腸炎、肝炎、發(fā)熱、腦膜炎、心肌炎等疾病,嚴重威脅到人類健康。這些病毒在胃腸道復制,主要通過糞口途徑傳播,是導致水源性疾病的一個重要原因。1988年上海30萬人暴發(fā)甲型肝炎病毒感染,系由于食用遭甲型肝炎病毒污染水體中養(yǎng)殖的毛蚶造成,1991印度的坎普爾由于使用了被戊型肝炎病毒污染的飲用水造成7.9萬人感染戊型肝炎。近年來屢見飲水受到腸病毒(enteic virus)污染引起腸道傳染病爆發(fā)的報道。2007年廣東省東莞市一起173例不明原因腹瀉流行,經(jīng)調(diào)查證實為諾如病毒污染飲水所致。飲用水安全與人們的生產(chǎn)生活息息相關,其病毒學安全性應該引起學界與有關管理部門高度重視。 許多國家都采用糞便污染指示菌,例如糞大腸菌群、總大腸菌群、腸球菌等來評價水體的衛(wèi)生微生物學質(zhì)量包括病毒污染狀況。研究發(fā)現(xiàn)水環(huán)境的細菌學水平和病毒濃度之間無明顯相關,同時病毒對外界環(huán)境和消毒作用的抵抗力更強,在滿足水體細菌學衛(wèi)生標準的情況下仍能檢測到病毒。因此目前各國普遍采用的指示菌不能準確反映水中病毒學安全性。直接對病毒進行檢測可以提供更可靠的水體病毒污染信息,進一步確保用水安全。但是,迄今國內(nèi)外尚未制定飲水病毒學標準和統(tǒng)一可行的水中病毒學檢測方法,根本原因在于其技術難度高、費用昂貴、工作量大,涉入門檻高,基礎科研數(shù)據(jù)積累少。嚴重制約了飲用水病毒學研究在國內(nèi)的開展。因此,本研究將從新材料、新配方、新的分子生物學檢測法多角度,探索建立可靠、有效的飲用水中病毒濃縮、檢測方法,并在制水生產(chǎn)實踐中檢驗諸方法應用效果。 僅就技術而言,首先環(huán)境水體中病毒濃度遠比臨床病人感染樣本低,如果特指可能存在于飲用水中的病毒,兩者相差最大可達1017數(shù)量級。采用最靈敏的臨床檢測方法也無法對飲水中病毒進行檢測。因此,欲開展飲用水病毒學研究,必須面對水中病毒濃縮技術與設備的挑戰(zhàn)。目前濃縮水中病毒的方法有：微孔濾膜吸附法、硅藻土吸附法、氫氧化鋁吸附沉淀法等。但因為材質(zhì)和材料物理化學性質(zhì)、洗脫液性質(zhì)、操作流程不同,導致各種濃集方法最終結果相差懸殊,使不同國家與地區(qū)結果缺乏可比性,難以統(tǒng)一,因此迫切需要探索建立一種高效、靈敏和簡捷的濃縮方法。本研究在此方面進行了初步嘗試,對比了國產(chǎn)微孔濾膜與進口NanoCeram濾芯初次濃縮病毒的效率。NanoCeram濾芯是一種新型的正電濾芯,因此國外相關實際應用的報道也相對較少。濾芯的表面積大500至600m2/g,能夠?qū)Σ煌瑵岫鹊拇篌w積水樣進行有效濃縮,不需調(diào)節(jié)水樣的pH等處理,可直接進行濃縮,操作過程簡單,且價格僅為1MDS濾芯的1/5。本研究首次在國內(nèi)將此濾芯應用于實際水樣病毒的濃縮,所獲實驗數(shù)據(jù)為國內(nèi)今后利用該濾芯提供了良好的參考依據(jù)。 研究水中病毒的第二個技術難點在于,操作步驟繁雜,第一次濃縮后并不能直接檢驗病毒,必須再進行第二次濃縮,使其最終體積縮小到類似于臨床標本體積。第二次濃縮方法有,絮凝沉淀、透析、超速離心等,由于待濃縮樣本體積仍然較大,后兩種方法不太實用,主要采用絮凝沉淀法。絮凝劑有無機絮凝劑和有機絮凝劑,種類繁多,理化性質(zhì)各異,尋找理想滿意的絮凝劑,需要具體問題具體分析,開展細致篩選研究。本研究探討了3種不同絮凝劑在二次濃縮中的最佳條件與效果,有機絮凝劑聚乙二醇擇優(yōu)而出。 濃縮過程結束,僅僅類似于完成了臨床標本的采集,隨之相應的除菌、選擇敏感宿主接種樣本,觀察病毒復制接踵而至。但是,環(huán)境中病毒與臨床檢驗巨大不同處是其多樣性,一個患者一般情況下只感染一種病毒,其實驗室敏感宿主細胞范圍較窄,容易確定�？墒�,環(huán)境水體中濃縮的病毒,可能為一種,也可能有多種數(shù)十種,不同病毒有其特定的敏感宿主,這為最終檢測環(huán)境病毒帶來極大的工作量。另外,有的病毒不能用細胞檢測,例如,諾如病毒,或有些病毒對細胞不敏感,例如,腺病毒F組40、41血清型,這為檢測環(huán)境病毒帶來極大不確定性。若要解決以上問題,只能從分子生物學領域借助工具,基因探針和聚合酶鏈反應(PCR)似乎能夠同時解決以上難題,但是基因探針因其靈敏度太低,已被淘汰,而最新的熒光定量PCR(qPCR)技術視乎可彌補上述所有不足。熒光定量PCR可對模板進行實時監(jiān)測,精確對起始模板進行定量,且檢測時間短,從病毒核酸提取到熒光定量PCR完成僅僅需要4-5小時,熒光定量PCR檢測范圍寬,靈敏度高,特異性強,顯示其在環(huán)境病毒學檢測中的巨大優(yōu)勢。盡管如此,對于具體的每一種病毒,qPCR技術并非唾手可得,針對不同病毒,其保守區(qū)引物設計,內(nèi)標構建,擴增產(chǎn)物特異性、檢測方法的靈敏度等,都需要探索研究。本研究針對不易培養(yǎng)的腺病毒F組40、41血清型、培養(yǎng)難度較大的A群輪狀病毒及具有普遍意義的整個腸道病毒屬,構建了相應的熒光定量PCR方法,成功實現(xiàn)對自來水廠水樣中相應病毒的檢測。 國外研究顯示病毒普遍存在于各種水體,例如江、河、湖、海、地下水,乃至經(jīng)過凈化處理過的自來水都含有一定量的病毒。國內(nèi)有研究人員檢測了渤海中腸道病毒的污染情況,檢測發(fā)現(xiàn)海水中腸道病毒濃度范圍為6.3×107拷貝/L至1.7×106拷貝/L,何等僅僅采集了2L水樣,發(fā)現(xiàn)輪狀病毒在北京水源水中的檢出率為34.6%,出廠水中的檢出率為11.7%,末梢水中的檢出率為22.4%。二十年前,張楚瑜等人對武漢東湖水廠腸道病毒進行檢測,原水病毒濃度均值為14.31PFU/L,陽性率為60%,出廠水濃度均值為6.7PFU/L,陽性率為35%,水廠水處理工藝對腸道病毒的去除率為53.18%。當時東湖是武漢武昌區(qū)的主要飲用水水源,然而隨著東湖水污染的日益加重,最后不得不放棄將其作為飲用水水源,改用長江水為唯一飲用水水源。武漢市是長江與漢江匯聚的大都市,武漢受惠于兩江,但也可能遭受其害。原因在于,隨著中國經(jīng)濟突飛猛進的發(fā)展,長江、漢江環(huán)境污染負荷日益加重,有報道,僅2007年一年長江就接受了300多億噸廢水。武漢有關部門最新公布資料,在武漢的18各水源保護地附近就有15處污水排放口,直接威脅到自來水廠取水安全。人們有理由為自己飲水的化學安全性、生物學安全性擔心。但是,有關利用長江與漢江作為水源的各自來水廠原水、出廠水是否存在病毒污染,其變化規(guī)律如何,一直是有待解開的迷。不僅如此,整個長江流域200多個大中小城市,甚至全國縣以上4000多個水廠也幾乎很少開展飲水病毒學研究。這種狀況與國際上同類研究差距甚遠,無論從學術上還是從生產(chǎn)實踐中都需要急起直追。本研究對武漢市兩江共6個自來水廠病毒污染狀況開展了一年四季的監(jiān)測調(diào)查,比較了出廠水與原水中腺病毒、輪狀病毒和腸道病毒的污染水平與去除率,考察了糞便污染指示菌、有關重要理化指標與病毒滅活的關系,對研究結果進行了科學謹慎的評價,填補了該領域的部分空白。 本研究主要包括下述三個部分： 第一部分飲用水中病毒濃縮方法的建立與比較 目的：測試評價NanoCeram濾芯對原水和飲用水中病毒初次濃縮的效果,比較無機絮凝Mg(OH)2法、有機絮凝法及PEG/NaCl對初次濃縮液進行二次濃縮的效果。 方法初次濃縮：以f2噬菌體為腸病毒代表,將f2噬菌體投加入50L長江、漢江混合原水中,配制模擬原水樣本,取100L實驗室末梢水,Na2S2O3中和余氯后投加f2噬菌體,配制模擬飲用水樣本。檢測水樣的濁度、溫度、pH值,采用NanoCeram正電濾芯濃縮模擬原水和飲用水樣中病毒,采用3%牛肉浸膏溶液pH值9.5洗脫濾芯。調(diào)整洗脫液pH值為7.0即得初次濃縮液。二次濃縮方法的選擇：200ml 3%牛肉浸膏溶液(pH值9.5)中加入一定量f2噬菌體,配制二次濃縮模擬樣。比較無機絮凝(Mg(OH)2)法、有機絮凝法及聚乙二醇(PEG)/NaCl法對病毒進行二次濃縮效果差異。無機絮凝法：在模擬水樣中加入一定量的1mol/L的氯化鎂溶液和1mol/L的磷酸氫二鉀溶液,調(diào)節(jié)溶液pH值為8.4。觀察絮凝形成情況,檢測樣本f2噬菌體的回收率。有機絮凝法：調(diào)節(jié)二次濃縮模擬水樣的pH值為1.5,2.0,3.0,3.5,4.0,5.0,7.0檢測不同pH下溶液的濁度及上清和沉淀中f2噬菌體含量,評價其濃縮效果。聚乙二醇(PEG)/NaCl法：比較不同濃度PEG8000的濃縮效果的差異(4%、6%、8%、10%、12%、13%、14%、16%、18%、20%(g/100ml))。f2噬菌體濃度的測定以Ecoil 285為其宿主菌,采用雙層瓊脂平板法進行檢測。 結果：NanoCeram濾芯初次濃縮法對原水中的f2噬菌體回收率為51.63%±26.60%,對飲用水中的f2噬菌體回收率為50.27%±14.35%。無機絮凝法由于洗脫存在一定困難,回收率較低。有機絮凝法中當溶液pH3時,溶液濁度較高,但是f2噬菌體的回收率仍較低(5%)。PEG8000濃度為4%和6%時f2噬菌體回收率小于3%;當濃度達到8%后,平均回收率可達70%以上；濃度達到13%時回收率最高達90.09%士10.50%。 結論：采用NanoCeram濾芯進行初次濃縮,聯(lián)合PEG8000/NaCl(13%)法進行二次濃縮是一種對飲用水病毒進行濃縮的高效方法。 第二部分熒光定量PCR檢測腺病毒、輪狀病毒和腸道病毒方法的建立 目的：制備熒光定量PCR檢測總的人腺病毒(HAdV)、人腺病毒F(HAdVF)、人輪狀病毒A(RVA)和腸道病毒(EV)的標準品,以制備的各病毒重組質(zhì)粒標準品進行各病毒的絕對定量。 方法：采用MA104細胞分離嬰兒糞便中人輪狀病毒。提取人腺病毒40DNA,脊髓灰質(zhì)炎病毒1型sabin株和分離的輪狀病毒RNA,并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設計合成HAdV、HAdVF、RVA和EV引物,以提取的人腺病毒血清型40 DNA,脊髓灰質(zhì)炎病毒1型sabin株和分離的輪狀病毒cDNA為模板進行梯度PCR優(yōu)化退火溫度,選擇最適退火溫度進行普通PCR。膠回收純化各病毒PCR產(chǎn)物,純化后DNA連接入pMD18-T Vector載體,轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)細胞,在LB/氨芐/IPTG/X-Gal平板上進行藍白篩選,LB培養(yǎng)基增殖各陽性克隆菌,提取菌液質(zhì)粒,測序。測序所得插入片段的堿基序列與模板基因輸入NCBI的BLAST序列類似性檢索工具進行一致性檢測。測定純化質(zhì)粒濃度并換算為拷貝數(shù)濃度,然后以構建成功的各病毒標準品建立熒光定量PCR檢測HAdV、HAdVF、RVA及EV的方法。評價各病毒標準品熒光定量PCR的穩(wěn)定性和敏感性。反應體系為(20μ1)：模板2μ1,SYBR Green 10μl,上游引物100nm/μ1,下游引物100nm/μl,無菌水補至20μl。反應條件為：50℃2min;95℃10min循環(huán)40次95℃15s,60℃15s,72℃30s,融解曲線：65℃-95℃。采用構建的標準品定量不同稀釋度的人腺病毒血清型40,脊髓灰質(zhì)炎病毒1型(Sabin株)及人輪狀病毒A,并比較各稀釋度病毒滴度與拷貝數(shù)濃度的相關性。 結果：HAdV、HAdVF、RVA和EV普通PCR最佳退火溫度為60℃,藍白篩選顯示連接、轉(zhuǎn)化成功,測序分析顯示各病毒的重組質(zhì)粒中含有各病毒的目的片段。所構建的HAdV熒光定量PCR標準品與目的基因片段(132 bp)一致度為99%；HAdVF標準品與目的基因片段(130 bp)一致度為100%；RVA標準品與目的基因片段(161bp)一致度為100%；EV標準品與目的基因片段(143bp)一致度為99%；各病毒熒光定量PCR標準品構建成功,可用于各病毒的絕對定量。純化后質(zhì)粒濃度分別為1.1×1011拷貝/μ1(HAdV);3.9×1010拷貝／μ1(HAdVF)；9.3×1010拷貝/μ1(EV)6.1×1010拷貝(?)μl(RVA)。不同稀釋度HAdV, HAdVF, RVA和EV(10-108拷貝/反應),擴增曲線分明,融解曲線呈單峰,且Tm分別為：85.4℃(HAdV),82.6℃(HAdVF),74.8℃(RVA),83.4 (EV),擴增效率為89%-99%。各病毒熒光定量PCR反應靈敏度為10拷貝／反應,HAdV稀釋度對數(shù)值與拷貝數(shù)濃度對數(shù)值存在線性相關,且R2=0.905。RVA稀釋度對數(shù)值與拷貝數(shù)濃度對數(shù)值存在線性相關,且R2=0.986。HAdVF稀釋度對數(shù)值與拷貝數(shù)濃度對數(shù)值存在線性相關,且R2=0.998。脊髓灰質(zhì)炎病毒稀釋度對數(shù)值與拷貝數(shù)濃度對數(shù)值存在線性相關,且R2=0.967。 結論：利用制備的HAdV、HAdVF、EV、RVA的重組質(zhì)粒標準品進行熒光定量PCR獲得的標準曲線具有較高的擴增效率和良好的線性關系,且產(chǎn)物特異性好,具有良好的重復性和穩(wěn)定性,該方法可用于對HAdV、HAdVF、EV和RVA的檢測。本研究建立的實時熒光定量PCR檢測HAdV、HAdVF、EV和RVA的線性范圍為10-1.0×108拷貝/μ1,檢測的靈敏度可達10拷貝／反應體系,能夠用于低濃度樣本的檢測。熒光定量PCR檢測HAdV、HAdVF、EV和RVA所得拷貝數(shù)值與稀釋度之間存在高度的相關性,對病毒的定量準確,可靠。 第三部分水廠原水和出廠水中腺病毒、輪狀病毒、腸道病毒的測定 目的：利用第一部分建立的飲用水中病毒濃縮方法和第二部分建立的HAdV、HAdVF、RVA和EV熒光定量PCR的方法,檢測武漢市6個水廠2011年4個季節(jié)原水和出廠水中HAdV, HAdVF, RVA和EV的污染情況,并對水廠的處理效果進行評價,探索病毒濃度和其他檢測指標的相關性。 方法：于2011年1月、4月、7月和10月用NanoCeram濾芯現(xiàn)場濃縮武漢市六家自來水廠(其中三座水廠以漢江水為水源水,另外三座以長江水為水源水)原水100L和飲用水200L,同時測定原水中pH、溫度、濁度、糞大腸菌群和出廠水中pH、溫度、濁度、游離余氯及糞大腸菌群。飲用水用終濃度為50mg/1 Na2S2O3中和余氯。每個樣本更換一個濾芯,將濾芯置于冰盒中低溫運輸至實驗室,3%牛肉浸膏溶液(pH值為9.5)600m1進行洗脫。調(diào)整洗脫液pH值為7.0,采用聚乙二醇(PEG)/NaCl法進行二次濃縮,于洗脫液中加入PEG8000(終濃度為13g/100ml),NaCl(1.2g/100ml),完全溶解后4℃靜置3h,10000g,離心30min,沉淀用PBS(pH值為7.0)洗脫,終體積為10ml。提取濃縮液中病毒DNA和RNA,并將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,進行熒光定量PCR檢測,監(jiān)測原水和飲水中HAdV、HAdVF. RVA和EV污染狀況,同時評價水廠的水處理效果,探索各病毒濃度、糞大腸菌群及濁度之間的相關性。評價原水和出廠水中可能產(chǎn)生的PCR抑制效應,及離心和稀釋處理對降低該效應的作用。 結果：2011年,武漢市六個自來水廠水源水和飲用水中HAdV. HAdVF和RVA的陽性率均為100%,EV原水中的陽性率為46%,飲用水中的陽性率為21%。長江水原水中各病毒濃度范圍如下HAdV:5.54x103拷貝/L-2.20x106拷貝/L; HAdVF:5.69x104拷貝/L-3.76×105拷貝/L；RVA：6.91×103拷貝/L-1.11×105拷貝/L；EV：0～7.95×103拷貝/L。漢江水原水中各病毒濃度范圍為HAdV:2.75x103拷貝/L-1.05×1O6拷貝/L；HAdVF:5.66×102拷貝/L-4.81×104拷貝/L;EV：0-5.56×103拷貝/L；RVA:4.84x103拷貝/L-4.52×104拷貝/L。EV清除率為97%,RVA為82%,HAdV為73%,HAdVF為72%。PCR抑制實驗中冬季原水投加一定量的HAdV標準品,檢出百分比為57.04%,春季原水檢出百分比為61.20%,冬季出廠水為96.46%,春季出廠水為91.07%,原水中PCR抑制作用較嚴重。比較同一樣本離心前后HAdV濃度變化發(fā)現(xiàn),對于不同樣本離心前后HAdV濃度在不同程度上均有所增加,增加百分比為29.7%-198.2%(t=10.235,P=0.000)。而同一樣本離心前后RVA濃度變化不明顯(t=1.027,P=0.338)。各樣本DNA稀釋兩倍后稀釋液加標回收率較原液加標回收率均有不同程度的增加,增加回收率為8.70%～55.90%。RVA cDNA稀釋液加標回收率較原液加標回收率均有不同程度的增加,增加回收率為6.43%-37.87%。長江原水HAdV濃度與濁度之間存在一定的正相關,(R2=0.768,P=0.004),漢江原水HAdVF與濁度之間存在一定的正相關相關,(R2=0.711,P=0.010)。其他病毒濃度與濁度之間的相關性并未發(fā)現(xiàn)。糞大腸菌群濃度與各病毒濃度之間均不存在明顯的相關性。RVA長江水和漢江水含量有差異,長江中濃度高于漢江(P=0.035)。 結論：離心和稀釋預處理是環(huán)境樣本中去除PCR抑制物的有效方法。本研究建立的病毒濃縮方法和熒光定量PCR研究結果表明,長江和漢江水原水中存在一定量的HAdV、HAdVF、RVA和EV。在滿足生活飲用水衛(wèi)生標準的出廠水中仍能檢測出HAdV、HAdVF、RVA和EV,現(xiàn)有的水處理措施尚不能保證對病毒的完全去除。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R123.1

【引證文獻】

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1 鄔曉齡;SiO_2/PVDF復合納濾膜的制備及其去除模型病毒的性能研究[D];華南理工大學;2013年

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本文編號：2377142