【摘要】：副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus, Vp)是一種食源性致病菌,廣泛分布于貝類及各種海產(chǎn)品中。Vp致病性菌株會(huì)引起傷口感染、敗血癥,或急性胃腸炎等疾病,出現(xiàn)腹瀉、頭痛、嘔吐、惡心和腹部絞痛等,通常直接生食或半生食海產(chǎn)品,或者食用經(jīng)Vp交叉感染的其他食品均會(huì)引發(fā)Vp食物中毒,可使免疫功能不全的人群引起嚴(yán)重的疾病,甚至死亡。Vp致病性菌株是引起亞洲國家,包括日本、中國等,食源性疾病的主要原因之一,也是在美國發(fā)生的海產(chǎn)品引起胃腸炎的主要原因。自2001以來,由于食用海產(chǎn)品引起的弧菌感染發(fā)病率持續(xù)增長,嚴(yán)重威脅公共健康。近年來,弧菌疾病爆發(fā)造成的水污染嚴(yán)重影響了個(gè)人、經(jīng)濟(jì)、社會(huì)以及公共健康衛(wèi)生。O3：K6血清型作為吻流行性菌株最主要的血清型,可產(chǎn)生耐熱性直接溶血素(TDH)或耐熱性相關(guān)溶血素(TRH)。Vp具有兩套Ⅲ型分泌系統(tǒng)T3SSs (I, II),可分泌效應(yīng)蛋白到宿主細(xì)胞質(zhì),引起細(xì)胞毒性和腸毒性。研究表明Vp大流行株中存在毒力島(Vpals),可引起人和動(dòng)物的腸道積水、水性腹瀉等疾病。盡管目前Vp引起腹瀉的具體機(jī)制尚不清楚,但腸道疾病與毒力特性(如黏附性)和其他毒力因子(如胞外酶、毒素TDH/TRH)有關(guān)。這些毒力因子為細(xì)胞毒素和腸毒素,已被多種細(xì)胞模型和動(dòng)物模型證實(shí),然而,毒力因子是否具有宿主特異性仍不清楚。而且,Vp流行菌株的原宿主鮮有報(bào)道,其主要原因是與其它食源性疾病相比,對致病性的不完全理解,包括環(huán)境、海產(chǎn)品分離株與臨床分離株的聯(lián)系。Vp感染與社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀態(tài)、氣象改變、供水質(zhì)量以及公共環(huán)境衛(wèi)生并沒有相關(guān)性。比較研究流行菌株和非流行菌株的差異性,雖可顯示流行菌株的演變,但目前尚不能明確地闡明其出現(xiàn)的原因。本研究利用非吞噬細(xì)胞系建立了體外細(xì)胞感染模型,比較了副溶血性弧菌臨床分離菌株與環(huán)境菌株誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性效應(yīng)及其評價(jià)指標(biāo)。在此基礎(chǔ)上,對Vp基因組中的部分推測的與致病性相關(guān)的基因進(jìn)行了敲除,研究其對細(xì)胞毒性和腸毒性的影響及其可能的作用機(jī)制,并應(yīng)用幼兔感染模型進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。通過體外免疫試驗(yàn)對副溶血性弧菌的先天性免疫特性進(jìn)行了研究,研究結(jié)果為Vp菌株的毒力評價(jià)及致病性分子機(jī)制的理解提供了新的方法與依據(jù)。我們對5株副溶血性弧菌菌株的毒力基因tdh、trh、tlh和orf8以及生長特征進(jìn)行研究,結(jié)果顯示分離株Vp024、Vp038和大流行株RIMD2210633(血清型O3：K6)具有相同的基因型,均為tlh+tdh+trh-orf8+,分離株Vp005基因型為tlh+tdh+trh-orf8-,分離株Vp029 tlh+tdh-trh-orf8-,菌株Vp038在37℃有氧培養(yǎng)條件下顯示了較高的最大群體密度,其它菌株具有相似的生長特性,所有菌株在0-2h內(nèi)增殖倍數(shù)沒有顯著差異(p0.05)。應(yīng)用非吞噬細(xì)胞系Caco-2建立體外感染模型測定了5株分離株的細(xì)胞毒性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞在感染后的不同階段和不同菌株之間差異程度不同,其中感染60min,不同菌株的黏附指數(shù)和侵襲指數(shù)均具有顯著差異,分離株Vp024和Vp005黏附指數(shù)顯著高于其它菌株(p0.05)；Vp024的侵襲指數(shù)顯著高于對照菌株和其它分離株(p0.01),但感染180min后菌株間差異性不顯著。對模型細(xì)胞的胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)、一氧化氮(nitric oxide, NO)、pH、鈣離子(Ca2+)以及線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP)水平測定結(jié)果顯示：Caco-2細(xì)胞感染副溶血性弧菌后,胞內(nèi)Ca2+水平明顯增加,NO水平顯著下降,但不同菌株之間沒有顯著差異；但胞內(nèi)ROS、pH和MMP水平變化具有菌株依賴性。對細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡結(jié)果顯示,分離株Vp024、Vp005和Vp029共培養(yǎng)3h誘導(dǎo)凋亡率顯著高于大流行株RIMD2210633。我們的研究結(jié)果表明所有副溶血性弧菌(包括大流行株和環(huán)境株)均能黏附和侵入非吞噬性上皮細(xì)胞,并且能夠通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)ROS在胞內(nèi)存活和復(fù)制,最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷,這種副溶血性弧菌誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷并不依賴于經(jīng)典的細(xì)胞凋亡機(jī)制。在此基礎(chǔ)上我們通過構(gòu)建RIMD2210633基因缺失株以及體外細(xì)胞模型進(jìn)一步研究了宿主細(xì)胞對毒力相關(guān)基因VPA1656、VP2118和VPA1321的反應(yīng),及其可能的致病性分子機(jī)制�；【F調(diào)節(jié)受體蛋白編碼基因VPA1656在正常情況對副溶血性弧菌細(xì)胞毒性和腸毒性沒有影響。鐵調(diào)節(jié)受體蛋白編碼基因VPA1656與該菌在體內(nèi)鐵離子攝取有關(guān),在鐵限制的條件下,通過利用胞內(nèi)鐵元素作為鐵離子來源,造成細(xì)胞損傷。我們構(gòu)建了RIMD2210633基因缺失株(RIMDΔVPA1656)并比較研究了VPA1656基因缺失株和野生型菌株的細(xì)胞毒性和腸毒性。結(jié)果表明突變株也能夠黏附和侵入體外培養(yǎng)的細(xì)胞,感染細(xì)胞的ROS、NO和胞內(nèi)pH參數(shù)下降水平顯著高于未感染細(xì)胞,Ca+2和MMP水平顯著高于對照細(xì)胞。而突變株誘導(dǎo)的LDH釋放和細(xì)胞死亡率和親本株沒有顯著區(qū)別。此外在幼兔體內(nèi)感染模型中,細(xì)菌的定植、存活以及腸液積水率均與親本株沒有顯著區(qū)別,組織病理學(xué)觀察顯示突變株和親本株均能夠引起感染動(dòng)物大部分腸道的壞死。在Vp基因組中有三個(gè)基因與Vp的抗氧化性脅迫有關(guān),其中VP2118是抗氧化脅迫的主要基因,但是VP2118與其在胞內(nèi)的存活和致病性的關(guān)系尚不清楚。我們發(fā)現(xiàn)腸道細(xì)胞中的活性氧水平對副溶血性弧菌的胞內(nèi)存活具有重要作用。為了理解VP2118基因?qū)Ω比苎曰【陌麅?nèi)存活和致病性的作用。我們構(gòu)建了VP2118基因敲除菌株(RIMDΔVP2118)并研究了突變株在體外Caco-2細(xì)胞模型和幼兔模型中的毒性。結(jié)果顯示RIMDΔVP2118的SOD活性顯著降低,并且通過基因互補(bǔ)可以回復(fù)突變。與野生菌株相比,RIMDΔVP2118黏附和侵襲指數(shù)以及對ROS的抵抗力顯著降低,通過VP2118基因互補(bǔ)可恢復(fù)感染能力。RIMDΔVP2118對非吞噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)顯著下降,誘導(dǎo)LDH、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞死亡率顯著降低于親本株；而且,細(xì)菌在體內(nèi)的生長和存活率相對于親本株有所下降；突變株誘導(dǎo)幼兔腸液積水率顯著降低,組織病理觀察顯示：感染野生菌株的幼兔腸道細(xì)胞壞死,而感染RIMDΔVP2118的幼兔大部分腸道內(nèi)壁僅出現(xiàn)局部輕微的細(xì)胞壞死。RIMDΔVP2118感染人非吞噬細(xì)胞,可刺激產(chǎn)生促炎因子和抗炎細(xì)胞因子的分泌,與親本株相比,突變株誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放顯著減弱(p0.01)。通過對比分析我們還發(fā)現(xiàn)體外的細(xì)胞毒性參數(shù)與幼兔模型中的腸毒性參數(shù)(體內(nèi)細(xì)菌存活率和腸液累積率)呈正相關(guān)。結(jié)果表明FeSOD基因(VP2118)主要通過提高副溶血性弧菌對非吞噬性腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生的ROS抗性,在動(dòng)物模型中提高了Vp在腸道中的存活率,進(jìn)一步提高了對宿主組織感染能力。VPA1321編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白,與Yersinia spp.和致病性大腸桿菌的細(xì)胞毒素高度同源,被認(rèn)為是主要的細(xì)胞毒性相關(guān)因子,但是我們的研究結(jié)果表明VPA1321對Vp在體外細(xì)胞感染模型中的毒力并沒有起主導(dǎo)作用。VPA1321基因敲除菌株(RIMDΔVPA1321)與親本株具有顯著差異性,突變株的細(xì)胞侵襲能力顯著下降；但仍然具有黏附細(xì)胞單層的能力。此外突變株在調(diào)節(jié)體外細(xì)胞模型參數(shù)(ROS, NO, pH, Ca+2,和MMP)以及誘導(dǎo)細(xì)胞釋放LDH等方面和親本株沒有顯著差異,親本株和突變株均能夠?qū)е峦暾?xì)胞的破壞。本論文利用FACS研究了Vp臨床分離株對非吞噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)。腸道致病菌獲得逃避宿主的先天性反應(yīng)的適應(yīng)性有助于其致病能力,并且防止其被快速消除,Vp的致病性是基于其黏附和入侵,我們通過感染細(xì)胞中ROS的變化證實(shí)增大Vp的ROS抵抗能力可促進(jìn)Vp在腸道中的存活,抑制宿主的氧化應(yīng)激反應(yīng),促進(jìn)組織感染。幼兔感染模型證實(shí)：Vp假設(shè)的超氧化物歧化酶(SODs)對耐受體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)具有重要作用,Vp可誘導(dǎo)抗氧化脅迫酶FeSOD基因(VP2118)與促進(jìn)Vp在腸道中的存活、促進(jìn)組織感染密切相關(guān),是產(chǎn)生體外細(xì)胞毒性和體內(nèi)腸毒性不可或缺的毒力因子。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R155.5

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本文編號：2366538