【摘要】：目的苯并[α]芘(Benzo(a)pyrene,B(a)P)是已知的致畸、致癌、致突變及內(nèi)分泌干擾物,大量的研究顯示,B(a)P可以引起子癇、子宮內(nèi)生長受限、流產(chǎn)等滋養(yǎng)層相關(guān)疾病,然而潛在機(jī)制尚不明確。本研究擬通過B(a)P在體內(nèi)的代謝終致突變物7,8-二羥基-9,10-環(huán)氧苯并[α]芘(BPDE)對滋養(yǎng)層細(xì)胞系Swan 71進(jìn)行染毒,觀察其細(xì)胞和線粒體功能的改變及其具體分子機(jī)制。探索線粒體損傷在滋養(yǎng)層細(xì)胞功能紊亂中的作用,為滋養(yǎng)層相關(guān)疾病的治療提供新的思路。方法1.MTT法檢測BPDE對Swan 71細(xì)胞活力的影響,根據(jù)結(jié)果確立染毒濃度和時(shí)間。采用Transwell的方法檢測各組細(xì)胞的侵襲能力;采用ELISA和Western blot的方法測定各組細(xì)胞HCG分泌能力;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡;酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA和SOD的含量;RT-qPCR檢測促炎因子(TNF-а、IL-6)mRNA的改變;熒光顯微鏡觀察線粒體膜電位的改變;透射電鏡觀察線粒體形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測線粒體DNA拷貝數(shù)的改變。2.采用RT-qPCR、Western blot技術(shù)檢測線粒體各組分裂融合基因和蛋白(Mfn1、Mfn2、OPA1、Drp1和Fis1)的表達(dá)情況。采用Western blot的方法對凋亡相關(guān)蛋白(P53、Bcl-2、Bak和Bax)、線粒體和胞漿中的Cyt c以及Caspase3前體和活化產(chǎn)物進(jìn)行檢測。結(jié)果1.BPDE對Swan 71細(xì)胞功能的影響與對照組相比,0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L和0.8μmol/L組Swan 71細(xì)胞的侵襲能力逐漸減弱,且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);與對照組相比,0.5μmol/L、1μmol/L和2μmol/L組Swan 71細(xì)胞上清中HCG的含量和細(xì)胞絨毛膜促性腺激素β蛋白的表達(dá)量逐漸降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);BPDE可以促進(jìn)Swan 71細(xì)胞凋亡,且0.5μmol/L、1μmol/L和2μmol/L組與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)2.BPDE對Swan 71細(xì)胞氧化損傷的影響與對照組相比,0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L和2μmol/L組細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA的水平逐漸增加,SOD的水平逐漸下降,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與對照組相比,1μmol/L和2μmol/L組促炎因子TNF-а和IL-6 mRNA表達(dá)逐步上調(diào),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。3.BPDE對Swan 71細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響隨著BPDE濃度的增加,線粒體膜電位逐漸降低;透射電鏡觀察,0.5μmol/L組線粒體線粒體腫脹扭曲,線粒體嵴紊亂,膜片段化,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹。1μmol/L組線粒體顯示出更嚴(yán)重的空泡化、破裂和溶解,線粒體嵴溶解,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈泡狀結(jié)構(gòu)。線粒體DNA拷貝數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,0.25μmol/L、0.5μmol/L和1μmol/L組與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.BPDE對Swan 71細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響隨著BPDE濃度的增加,P53、Bak1和Bax的蛋白表達(dá)量逐漸增加,Bcl-2的蛋白表達(dá)量逐漸降低。且除P53 0.25μmol/L組外各染毒組與對照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.BPDE對Swan 71細(xì)胞分裂融合基因的影響與對照組相比,0.5μmol/L、1μmol/L和2μmol/L組線粒體融合基因OPA1、Mfn1和Mfn2表達(dá)逐漸下降,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);0.5μmol/L、1μmol/L和2μmol/L組線粒體分裂基因Fis1表達(dá)逐漸上調(diào),1μmol/L和2μmol/L組Drp1表達(dá)逐漸上調(diào),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與對照組相比,0.5μmol/L、1μmol/L和2μmol/L組線粒體融合蛋白OPA1表達(dá)逐漸下降,各染毒組中Mfn1和Mfn2表達(dá)逐漸下降,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);各染毒組中Drp1和Fis1表達(dá)逐漸上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。6.BPDE對Swan 71細(xì)胞Cyt c釋放和Caspase 3的影響隨著BPDE濃度的增加,胞漿中的Cyt c蛋白的含量逐漸增加,而線粒體中的Cyt c蛋白的含量逐漸下降,Caspase 3前體逐漸減少,而活化的Caspase 3逐漸增多,且除0.25μmol/L組外差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論BPDE可誘導(dǎo)Swan 71細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷引起線粒體分裂增加而融合下降,造成線粒體膜片段化釋放Cyt c,引發(fā)線粒體途徑的凋亡,導(dǎo)致Swan 71細(xì)胞侵襲和HCG分泌功能障礙,為BPDE引起的滋養(yǎng)層相關(guān)疾病治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:Benzo (a) ptyrene, B (a) P) is a known carcinogens, carcinogenic, mutagenic and endocrine disruptors, and a large number of studies show that B (a) P can induce trophoblast-related diseases such as eclampsia, intrauterine growth restriction, abortion, etc. However, the underlying mechanism is not yet clear. In this study, the change of cell and mitochondrial function and its specific molecular mechanism were observed by B (a) P metabolism in the body. The changes of cell and mitochondrial function and their specific molecular mechanism were observed in the trophoblast cell line Swan 71. To explore the role of mitochondrial damage in the functional disturbance of trophoblast cells and to provide a new idea for the treatment of trophoblast-related diseases. Methods 1. MTT assay was used to detect the effect of BPDE on the viability of Swan 71 cells, and the concentration and time of exposure were established according to the results. The invasion ability of all groups of cells was detected by Transwell's method, and the secretion ability of the cells was determined by ELISA and Western blot. The cell apoptosis was detected by flow cytometry. The contents of ROS, MDA and SOD in cells were detected by ELISA. The changes of the expression of TNF-CoV and IL-6 mRNA were detected by RT-qPCR. The changes of mitochondrial DNA number were observed by fluorescence microscope; the changes of mitochondrial morphology and structure were observed by transmission electron microscope; the change of mitochondrial DNA copy number was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. RT-qPCR and Western blot were used to detect the expression of fusion genes and proteins (Mfn1, Mfn2, OPA1, Drp1, and CD1). Apoptosis-related proteins (P53, Bcl-2, Bk and Bax), Cyt c in mitochondria and cytoplasm, and Caspase3 precursor and activation products were detected by Western blot. Results 1. The effect of BPDE on the function of Swan 71 cells was 0. 1. mol/ L, 0.2. mol/ L, 0.4. mol/ L and 0.9. mol/ L, and the invasive ability of Swan 71 cells was decreased gradually, and the difference was statistically significant (P0.05). In 1. mol/ L and 2. m mol/ L group of Swan 71 cells, there was a statistically significant difference (P0.05). The BPDE could promote the apoptosis of Swan 71 cells and 0.5mumol/ L. Compared with the control group, the effect of BPDE on the oxidative damage of Swan 71 cells was 0. 25 ug/ L, 0.5. mol/ L, 1. m mol/ L and 2. m mol/ L, the levels of ROS and MDA increased gradually, and the level of SOD decreased gradually. The difference was statistically significant (P0.05). Compared with the control group, the expression of TNF-and IL-6 mRNA was up-regulated in 1. m u.mol/ L and 2. m mol/ L group, and the difference was statistically significant (P0.001). The effect of BPDE on the mitochondrial structure and function of Swan 71 cell decreased with the increase of BPDE concentration. Mitochondrial DNA was gradually decreased; transmission electron microscope observation, 0. 5 ug/ L group of mitochondrial swelling distortion, mitochondrial membrane disturbance, membrane fragmentation, reticulum swelling. 1. mu mol/ L group of mitochondria showed more serious vacuolization, rupture and dissolution, mitochondria were dissolved, and the Endoplasmic reticulum was in a bubble structure. Compared with the control group, the effect of BPDE on the apoptosis-related protein of Swan 71 cells increased with the increase of BPDE concentration, and the expression of P53, Bak1 and Bax increased gradually. The expression of Bcl-2 protein decreased gradually. Compared with the control group, the expression of OPA1, Mfn1 and Mfn2 in the mitochondrial fusion gene OPA1, Mfn1 and Mfn2 decreased gradually. The differences were statistically significant (P 0.05); 0. 5. m u.mol/ L, 1. m mol/ L and 2. m u.mol/ L, the expression of DS1 was gradually increased, and the expression of Drp1 in 1. m u.mol/ L and 2. m u.mol/ L groups was gradually increased, and the difference was statistically significant (P0.05). Compared with the control group, the expression of OPA1 in 0.5. mol/ L, 1. m mol/ L and 2. m mol/ L group decreased gradually, and the expression of Mfn1 and Mfn2 in each group was gradually decreased, and the difference was statistically significant (P0.05). The difference was statistically significant (P0.001). The effect of BPDE on the release of Cyt c and Caspase 3 in Swan 71 cells increased with the increase of BPDE concentration, the content of Cyt c protein in cytoplasm gradually increased, and the content of Cyt c protein in mitochondria gradually decreased, Caspase 3 precursor decreased gradually, and the activated Caspase 3 increased gradually. All the differences were statistically significant except for 0. 25 ug/ L group (P0.05). Conclusion BPDE can induce the increase of mitochondrial fragmentation caused by oxidative damage of Swan 71 cells, which causes mitochondrial membrane fragmentation to release Cyt c and induce apoptosis of mitochondrial pathway, which leads to the invasion of Swan 71 cells and the dysfunction of urinary tract secretion. provides experimental basis for the treatment of trophoblast related diseases caused by BPDE.
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R114

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 于春艷;李洪巖;康勁松;鐘加滕;孫連坤;;線粒體分裂融合基因在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞損傷中的作用[J];中國婦幼保健;2009年33期

2 張子怡;張勇;;線粒體動(dòng)態(tài)變化與線粒體質(zhì)量控制:運(yùn)動(dòng)的適應(yīng)與調(diào)節(jié)[J];中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志;2011年09期

3 張寧;王士雷;李淑虹;李瑜;王鵬;賈長新;;線粒體分裂蛋白抑制劑在大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用及其機(jī)制(英文)[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2013年18期

4 楊軼;楊敏;;線粒體融合與分裂:治療缺血性心臟疾病的潛在靶點(diǎn)[J];今日藥學(xué);2012年12期

5 阿力木江·買買提江;高秀芳;金波;施海明;;線粒體動(dòng)力學(xué)與心肌細(xì)胞能量代謝的研究進(jìn)展[J];復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2013年05期

6 郝希純;王東明;;Drp1蛋白調(diào)節(jié)線粒體分裂機(jī)制及其在疾病中的作用[J];廣東醫(yī)學(xué);2011年08期

7 賀文鳳;曹青;洪葵;;線粒體對iPSC再程序化的影響[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2013年03期

8 張倩;張宏偉;夏建華;連亞軍;謝南昌;;線粒體分裂蛋白抑制劑對癲癇大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響[J];河南醫(yī)學(xué)研究;2014年02期

9 許美芬;何軼群;管敏鑫;;線粒體融合、分裂與神經(jīng)變性疾病[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2013年12期

10 韓小建;萬玉英;楊章堅(jiān);張劍鋒;危永芳;賴啟南;;利用蛋白導(dǎo)入法沉默線粒體分裂調(diào)節(jié)蛋白Drp1的表達(dá)[J];重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2014年05期

相關(guān)會議論文 前10條

1 楊軼;楊敏;;線粒體融合與分裂:治療缺血性心臟疾病的新靶點(diǎn)?[A];2011年中國藥學(xué)大會暨第11屆中國藥師周論文集[C];2011年

2 楊軼;劉居理;楊敏;;線粒體融合和分裂與心臟疾病[A];中國藥理學(xué)會第十一次全國學(xué)術(shù)會議�？痆C];2011年

3 于瀅;王瑞元;;運(yùn)動(dòng)對不同組織線粒體動(dòng)力學(xué)的影響[A];2013年中國生理學(xué)會運(yùn)動(dòng)生理學(xué)專業(yè)委員會年會暨“運(yùn)動(dòng)與健康”學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2013年

4 于瀅;王瑞元;;運(yùn)動(dòng)對不同組織線粒體動(dòng)力學(xué)的影響[A];2013年中國生理學(xué)會運(yùn)動(dòng)生理學(xué)專業(yè)委員會年會暨“運(yùn)動(dòng)與健康”學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2013年

5 楊軼;楊敏;;線粒體融合與分裂:治療缺血性心臟疾病的潛在靶點(diǎn)~[A];2014年廣東省藥師周大會論文集[C];2014年

6 王雁玲;秦力;柏素霞;仇巍;莊臨之;;黏附分子和金屬蛋白酶系統(tǒng)與胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的有節(jié)制侵入[A];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)、免疫細(xì)胞生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)專業(yè)委員會學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2002年

7 陳芝蘭;呂美玲;莊國強(qiáng);汪海林;;對氧化損傷敏感的細(xì)菌傳感器的研究[A];中國化學(xué)會第27屆學(xué)術(shù)年會第02分會場摘要集[C];2010年

8 李蕓;羅云敬;王云海;鐘儒剛;;過亞硝酸根對DNA氧化損傷及其抑制作用研究[A];第二屆全國環(huán)境化學(xué)學(xué)術(shù)報(bào)告會論文集[C];2004年

9 陳穎麗;李前忠;;不同亞細(xì)胞位置的細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性分析[A];第十一次中國生物物理學(xué)術(shù)大會暨第九屆全國會員代表大會摘要集[C];2009年

10 孫英麗;趙允;朱山;翟中和;;植物細(xì)胞凋亡及其機(jī)理的研究[A];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會第七次會議論文摘要匯編[C];1999年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 商東;“細(xì)胞凋亡”與臨床醫(yī)學(xué)[N];中國醫(yī)藥報(bào);2001年

2 張志軍;細(xì)胞凋亡與中醫(yī)藥[N];中國醫(yī)藥報(bào);2002年

3 ;“細(xì)胞凋亡療法”正逐步成為治療癌癥的新途徑[N];中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報(bào);2002年

4 記者張建松;治療癌癥新途徑：細(xì)胞凋亡療法[N];科技日報(bào);2002年

5 李明輝;“細(xì)胞凋亡”治癌癥[N];醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);2002年

6 洪敏;細(xì)胞凋亡研究引人關(guān)注[N];中國醫(yī)藥報(bào);2008年

7 陶春祥;細(xì)胞凋亡對心臟疾病的影響[N];中國醫(yī)藥報(bào);2003年

8 本報(bào)實(shí)習(xí)記者 梁媛媛;薛定：發(fā)現(xiàn)癌癥“開關(guān)”[N];北京科技報(bào);2010年

9 高書明;誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[N];中國醫(yī)藥報(bào);2004年

10 勇匯;中藥誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡研究進(jìn)展[N];中國醫(yī)藥報(bào);2002年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 李國兵;Cofilin調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡和線粒體自噬的作用機(jī)制及其干預(yù)策略研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

2 喬沛豐;外源性硫化氫對N2a細(xì)胞和APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠線粒體分裂融合的影響及機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2016年

3 張宏偉;鋰—匹羅卡品致癇大鼠海馬神經(jīng)元線粒體分裂變化研究[D];鄭州大學(xué);2015年

4 陳方哲;PINK1基因通過線粒體分裂融合途徑對腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

5 李夏春;人全長Tau蛋白過度表達(dá)對線粒體分裂融合動(dòng)態(tài)及細(xì)胞退變的影響[D];華中科技大學(xué);2013年

6 侯東霞;豬滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定及ROCK抑制劑Y-27632對其影響的研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

7 阮紅峰;維生素C調(diào)控滋養(yǎng)層干細(xì)胞分化和妊娠維持的效應(yīng)及分子機(jī)制[D];浙江大學(xué);2015年

8 高丹忱;Dynamins在小鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制及Dynasore的保護(hù)作用[D];浙江大學(xué);2013年

9 張曦倩;ERK信號傳導(dǎo)通路在滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲過程中的作用[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2005年

10 劉玉和;氧化應(yīng)激誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞死亡過程中溶酶體—線粒體途徑的作用機(jī)制[D];吉林大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 韓雙雪;淫羊藿苷修復(fù)阿爾茲海默癥線粒體分裂—融合動(dòng)力學(xué)失衡的機(jī)制研究[D];深圳大學(xué);2015年

2 陳咪咪;MCU介導(dǎo)線粒體分裂蛋白Drp-1在人中性粒細(xì)胞遷移中的作用[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

3 張楠;大鼠骨骼肌鈍挫傷恢復(fù)過程中線粒體融合—分裂基因表達(dá)情況的研究[D];山東體育學(xué)院;2015年

4 周永方;線粒體分裂調(diào)控因子drp-1對于線蟲壽命的調(diào)節(jié)功能研究[D];杭州師范大學(xué);2016年

5 陳俊莉;阿魏酸通過誘導(dǎo)線粒體自噬保護(hù)糖氧剝奪引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2016年

6 王瑞肖;解偶聯(lián)蛋白2減緩高糖加重缺氧性神經(jīng)細(xì)胞損傷及其與線粒體分裂/融合關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2016年

7 曹海燕;線粒體分裂與鈣信號交互作用促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2016年

8 王穎;血紅素氧合酶1對內(nèi)毒素致急性肺損傷大鼠的線粒體融合—分裂的影響[D];天津醫(yī)科大學(xué);2016年

9 李剛;線粒體分裂抑制劑-1在大鼠急性脊髓損傷中的保護(hù)作用及其機(jī)制[D];遼寧醫(yī)學(xué)院;2015年

10 申菲菲;線粒體分裂在甲狀腺鱗癌細(xì)胞SW579細(xì)胞增殖、凋亡以及侵襲中的作用[D];遼寧醫(yī)學(xué)院;2015年

，

本文編號：2307387