發(fā)布時(shí)間：2018-10-16 13:30

【摘要】：亨廷頓病（Huntington’s disease,HD）是一種常染色體顯性遺傳的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，影響肌肉的協(xié)調(diào)并導(dǎo)致認(rèn)知功能減退和癡呆。HD由HD基因突變導(dǎo)致。HD基因可編碼亨廷頓蛋白（huntingtin，Htt）。在正常人群中，HD基因中CAG的重復(fù)數(shù)為10-35個(gè)。當(dāng)HD基因發(fā)生突變，CAG重復(fù)數(shù)超過35時(shí)便出現(xiàn)HD。突變HD基因的第一外顯子中的CAG重復(fù)序列異常增加（超過35次），其編碼的Htt氨基末端中的谷氨酰胺重復(fù)序列異常擴(kuò)展。這種突變可導(dǎo)致紋狀體(尾狀核和殼核)內(nèi)中等大小有棘神經(jīng)元細(xì)胞死亡，尤其是投射性GABA神經(jīng)元和III、V、VI層大腦運(yùn)動(dòng)皮層的錐體細(xì)胞發(fā)生退行性變和死亡，這些與紋狀體的萎縮有關(guān)。目前減緩HD進(jìn)展的方法有：減少的突變Htt的產(chǎn)生；提高細(xì)胞的生存能力，更換丟失的神經(jīng)元等。正常Htt在神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)呈彌散分布，而在HD患者和HD轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的腦內(nèi)，突變Htt在細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊而形成不可溶的聚集物定位在神經(jīng)元核內(nèi)和突起(包括軸突和軸突終末)內(nèi)，分別稱為核內(nèi)聚集物(intranuclear aggregates)和神經(jīng)氈聚集物(neuropil aggregates)。這種聚集物在HD的發(fā)病過程中扮演著重要角色。 盡管HD的發(fā)病基因已被找到，但發(fā)病的機(jī)制目前還不清楚，至今也無有效治療HD的方法。真核細(xì)胞主要通過泛素-蛋白酶體與自體吞噬系統(tǒng)降解蛋白質(zhì)，增強(qiáng)突變Htt的清除對于防止亨廷頓病病理發(fā)生至關(guān)重要，這一過程主要由泛素-蛋白酶體與自體吞噬途徑介導(dǎo)。大量體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，，在HD中，突變Htt可誘發(fā)氧化應(yīng)激，后者可進(jìn)一步損壞UPS功能而導(dǎo)致突變Htt聚集。因此，抗氧化藥物已經(jīng)成為治療HD的一大焦點(diǎn)。 黃酮類化合物是有超過6000個(gè)不同的化合物的植物次生代謝產(chǎn)物的一個(gè)大集團(tuán)。對黃酮類化合物的大量觀測，在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)都表明其生理和生物學(xué)效應(yīng)廣泛。生物學(xué)功能如抗過敏，抗炎，抗病毒，抗癌和抗增殖活性，這些早已被確認(rèn)。幾種黃酮類化合物已被證明對各種誘變劑或致癌物質(zhì)的具有抗突變作用。黃酮類化合物還能發(fā)揮多重保護(hù)作用，包括潛在的神經(jīng)元損傷保護(hù)作用；抑制發(fā)炎反應(yīng)；和潛在的促進(jìn)學(xué)習(xí)，記憶與認(rèn)知的功能等。 異鼠李素（Isorhamnetin），也稱3,5,7-三羥基-2-(4-羥基-3-甲氧基苯基)苯并吡喃-4-酮，是一種黃酮類化合物，它是希臘和丹麥的一種食品，也存在于中國沙棘果汁中。該藥具有抗脂質(zhì)過氧化，擴(kuò)冠，抑制血小板聚集，降低大鼠血清和肝臟的膽固醇濃度等功能。 本研究利用HD細(xì)胞模型觀察了異鼠李素對突變Htt細(xì)胞毒性的影響并探索其機(jī)制。結(jié)果表明，異鼠李素能抑制突變Htt細(xì)胞毒性，其機(jī)制除了其具有的抗氧化作用之外，更重要的是促進(jìn)了突變Htt的蛋白酶體性和自噬性途徑降解。 1.異鼠李素抑制突變Htt對N2a細(xì)胞的毒性 為探討異鼠李素對突變Htt毒性的影響，我們分別用1.0μg的cherry-20Q(表達(dá)正常htt)或cherry-160Q(突變Htt)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞，6h后用不同濃度的異鼠李素處理轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)（Trypan Blue)染色檢測細(xì)胞活性。結(jié)果表明，異鼠李素處理可明顯降低160Q細(xì)胞中臺(tái)盼藍(lán)染色陽性細(xì)胞的百分率，說明異鼠李素處理能呈劑量依賴性抑制160Q細(xì)胞的活性下降。進(jìn)一步的內(nèi)源性激活型caspase3水平的免疫印跡檢測顯示，異鼠李素處理能呈劑量依賴抑制突變Htt對caspase3的激活。由此表明，異鼠李素對突變Htt的細(xì)胞毒性具有明顯的抑制作用。 2.異鼠李素能降低表達(dá)突變Htt的N2a細(xì)胞內(nèi)聚集型和可容型Htt 為了明確異鼠李素對突變Htt聚集物形成的影響，對表達(dá)突變Htt的細(xì)胞內(nèi)聚集物的含量在經(jīng)異鼠李素處理后的變化進(jìn)行了檢測。在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)異鼠李素處理后表達(dá)160Q的N2a細(xì)胞中突變Htt聚集物的數(shù)量明顯減少。異鼠李素呈劑量依賴性抑制160Q細(xì)胞聚集物的形成。通過Western Blot技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)突變Htt聚集物在表達(dá)160Q的細(xì)胞內(nèi)呈時(shí)間依賴性增加，異鼠李素處理后，可溶型與聚集型突變亨廷頓蛋白顯著降。因此，異鼠李素導(dǎo)致的突變Htt含量減少可能通過促進(jìn)突變Htt的降解和/或抑制突變Htt聚集所致。 3.異鼠李素減少突變Htt聚集物與Nrf2通路的激活相關(guān) 為了了解異鼠李素是否通過激活Nrf2通路的來減少突變Htt聚集物，對調(diào)節(jié)抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant responsive element, ARE）轉(zhuǎn)錄因子核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2related factor2, Nrf2）在異鼠李素減少突變聚集物的作用進(jìn)行了檢測。免疫印跡分析顯示，異鼠李素處理后的160Q細(xì)胞內(nèi)Nrf2表達(dá)水平較未處理的160Q細(xì)胞明顯升高。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)處理的對照組相比，異鼠李素也增加HO-1蛋白的水平（這是一種細(xì)胞保護(hù)酶，在炎癥過程中防御氧化損傷起關(guān)鍵作用）。這些結(jié)果表明，異鼠李素可以激活Nrf2-ARE途徑，這被認(rèn)為是對氧化應(yīng)激的保護(hù)機(jī)制；從而降低突變HTT的聚集和毒性作用。因此，異鼠李素減少突變Htt聚集物與Nrf2通路的激活相關(guān)。 4.異鼠李素促進(jìn)突變Htt的蛋白酶體途徑和自噬途徑降解 為了明確蛋白酶體途徑是否參與了異鼠李素對突變Htt的降解，首先我們檢測了蛋白酶體抑制劑MG132能否阻斷異鼠李素對突變Htt的降解作用。免疫印跡結(jié)果顯示，在異鼠李素處理的160Q中加入MG132可阻斷異鼠李素減少聚集型突變Htt的作用，但不能阻斷可溶型突變Htt的降低。 異鼠李素還可以減少可溶型突變Htt，但MG132不能阻斷這一現(xiàn)象，因此，推測其他降解途徑可能也參與了異鼠李素促進(jìn)可溶型突變Htt降解的過程。首先我們考慮是否自噬降解途徑參與了這一過程，為此，我們在異鼠李素處理的160Q細(xì)胞中加入自噬抑制劑3-Methyladenine(3—MA)。結(jié)果顯示，3—MA可阻斷異鼠李素減少可溶型突變Htt的作用。以上結(jié)果顯示，異鼠李素通過促進(jìn)蛋白酶體途徑和誘導(dǎo)激活自噬途徑降解繼而促進(jìn)聚集型和可溶型突變Htt的降解。 結(jié)論：異鼠李素可以通過多種途徑降解突變Htt:促進(jìn)蛋白酶體系統(tǒng)降解聚集型突變Htt;誘導(dǎo)激活自噬系統(tǒng)，降解可容型突變Htt;通過促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）的表達(dá)，進(jìn)而有效抑制突變Htt的氧化應(yīng)激作用，促進(jìn)細(xì)胞生存。異鼠李素正是通過以上途徑使突變Htt減少是其抑制突變Htt細(xì)胞毒性的主要機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R114

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2274511