發(fā)布時間：2018-07-01 18:28

  本文選題：阪崎腸桿菌 + 抗體�。� 參考：《南昌大學》2012年碩士論文

【摘要】：阪崎腸桿菌(Cronobacter spp.)是一種重要的食源性條件致病菌,能夠引起嚴重的新生兒腦膜炎、壞死性結(jié)腸炎和菌血癥等疾病,導(dǎo)致較高的死亡率(40‰80%)和嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)損傷后遺癥,以及發(fā)育障礙。加強對食品中阪崎腸桿菌的早期監(jiān)控及其引起的疾病診斷,對于預(yù)防和控制大規(guī)模感染疫情的爆發(fā)具有重要意義。為此,本研究擬建立針對奶粉樣本中阪崎腸桿菌的快速、靈敏、準確的檢測平臺。本文利用納米磁珠,結(jié)合免疫學與分子生物學的技術(shù)手段,創(chuàng)建了檢測奶粉樣本中阪崎腸桿菌的免疫磁珠和探針磁珠捕獲的方法。采用阪崎腸桿菌菌體碎片作為免疫原進行動物免疫,制備獲得了效價為106的多克隆抗體；采用菌體逆向吸附法和辛酸硫酸銨沉淀法純化多克隆抗體,有效消除了多抗與副溶血弧菌和鼠傷寒沙門氏菌的交叉反應(yīng),獲得了特異性的阪崎腸桿菌抗體。利用純化后的抗體偶聯(lián)于納米磁珠表面,制備能夠特異性識別、捕獲阪崎腸桿菌的免疫磁珠,結(jié)合巢氏PCR檢測技術(shù),其檢測限可達5CFU/mL。同時,利用阪崎腸桿菌的特異性探針和納米磁珠制備的核酸探針磁珠,捕獲樣本中的目的基因序列,其檢測靈敏度為103 CFU/mL。以上兩種方法均不受高濃度雜菌和奶粉樣品本身干擾,可有效用于食品中阪崎腸桿菌的檢測。本研究篩選制備了抗阪崎腸桿菌的單克隆抗體,并建立了兩種特異性檢測阪崎腸桿菌的免疫試紙條方法—膠體金試紙條和熒光微球試紙條。通過奶粉樣本的實際檢測評估,表明膠體金試紙條和熒光微球試紙條檢測阪崎腸桿菌靈敏度分別為106CFU/mL和105 CFU/mL,可在15 min完成檢測；并且不受高濃度雜菌和奶粉樣品本身干擾。以上方法的建立為實現(xiàn)應(yīng)用于基層的檢測阪崎腸桿菌試紙條的商業(yè)開發(fā)提供了技術(shù)基礎(chǔ)。為了改進阪崎腸桿菌定性定量的檢測方法,本研究利用消除了交叉反應(yīng)的阪崎腸桿菌多抗,通過Western Blotting篩選到4種阪崎腸桿菌的蛋白抗原(ATPsyn, Maltoporin, CP783, OmpA)。其中ATPsyn, Maltoporin, CP783分別被克隆表達,經(jīng)、Vestern Blotting驗證,CP783可作為特異性抗原,并制備相應(yīng)的多克隆抗體,進一步檢驗了CP783可以作為阪崎腸桿菌特異性檢測抗原。此外本文分析了阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶、OmpA和CP783的抗原表位,選取特異性肽段,獲得對應(yīng)的單克隆抗體,發(fā)現(xiàn)3個蛋白的單抗均可識別所有阪崎腸桿菌。然而,單抗均與部分非阪崎腸桿菌存在交叉反應(yīng),不適合用于阪崎腸桿菌的特異性檢測。目前,阪崎腸桿菌的免疫學檢測方面的研究在國內(nèi)外報道較少。本文的研究成果將有助于建立阪崎腸桿菌的快速檢測平臺,開拓食品安全檢測的新方法,為阪崎腸桿菌的監(jiān)測提供了有效的檢測技術(shù)手段,同時也為阪崎腸桿菌特異性抗原的篩選和驗證提供了前期探索,為阪崎腸桿菌特異性蛋白抗原的研究提供了工作基礎(chǔ)。
[Abstract]:Cronobacter spp. It can cause severe neonatal meningitis, necrotizing colitis, bacteremia and other diseases, leading to higher mortality (40 鈥，

本文編號：2088681