發(fā)布時(shí)間：2018-06-11 14:08

  本文選題：對(duì)氨基水楊酸鈉 + 錳�。� 參考：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：【目的】錳是人體必需微量元素,但長期過量錳暴露可引起錳中毒。錳中毒不僅損傷錐體外系,而且累及腦的其他部位包括皮層、海馬和丘腦。炎癥是神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)重要過程,且MAPK信號(hào)通路可能是錳神經(jīng)毒性的主要靶通路。體內(nèi)外研究顯示,非甾體抗炎藥通過抑制炎癥反應(yīng)和小膠質(zhì)細(xì)胞活性來干預(yù)多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性退化,具有保護(hù)神經(jīng)作用。對(duì)氨基水楊酸鈉(PAS-Na)是一種非甾體抗炎類藥物,我室率先應(yīng)用PAS-Na治療錳中毒病人效果較好。本研究擬通過體內(nèi)毒理學(xué)試驗(yàn),采用石墨爐原子吸收光譜法、免疫組化、酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法(ELISA)、Real-Time PCR和Western Blot等技術(shù)從MAPK信號(hào)通路探討錳致大鼠皮層、海馬和丘腦炎癥反應(yīng)及PAS-Na的干預(yù)機(jī)制�！痉椒ā縿�(dòng)物分組及處理:SPF級(jí)雄性成年SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,(1)短期重復(fù)實(shí)驗(yàn):SPF級(jí)雄性SD大鼠40只,體重(184.5±10.7)g,隨機(jī)分為染錳組和正常對(duì)照組(對(duì)照組),每組20只。染錳組腹腔注射(ip)15 mg Mn Cl2/kg,對(duì)照組ip等容量生理鹽水,每日1次,每周5天,連續(xù)4周。(2)亞慢性實(shí)驗(yàn):SD雄性大鼠,體重(80±20)g,隨機(jī)分為對(duì)照、高劑量PAS-Na對(duì)照組(PAS對(duì)照)、染錳、PAS-Na預(yù)防性干預(yù)(PAS預(yù)防)組和低、中、高劑量PAS-Na(L-、M-、H-PAS)治療組,觀察期為8、12、18周。染錳、PAS預(yù)防及各劑量PAS-Na治療組ip 15 mg Mn Cl2/kg,對(duì)照組和觀察期18周的PAS對(duì)照組ip等容量生理鹽水,每日1次,每周5天,連續(xù)8或12周;其中PAS預(yù)防組在染錳的同時(shí),每天背部皮下注射(sc)240 mg PAS-Na/kg,每天一次,每周5天,連續(xù)8和12周;觀察期8或12周的PAS對(duì)照組每天背部皮下sc 240 mg PAS-Na/kg,每天一次,每周5天,連續(xù)8或12周。然后,L-、M-、H-PAS治療組及觀察期18周的PAS對(duì)照組分別sc 80、160、240 mg、240 mg PAS-Na/kg,其余組背部sc等容量生理鹽水,每日1次,每周4天停藥3天,連續(xù)6周。使用的各劑量PAS-Na溶液的PH約為6.7左右;Mn Cl2 PH為5.5至5.7左右。實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定:(1)生長發(fā)育指標(biāo)檢測(cè):每周日稱動(dòng)物體重1次;實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),處死動(dòng)物,取軟組織臟器包括心、脾、肝、肺、睪丸、腎等臟器,并稱重,計(jì)算其臟器系數(shù)比;(2)空間學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè):實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1周,每組隨機(jī)抽取10只動(dòng)物進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)以測(cè)試其學(xué)習(xí)記憶能力改變;(3)石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定全血錳和腦錳(丘腦、海馬和皮層)含量;(4)免疫組化檢測(cè)皮層、海馬和丘腦膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、bax、bcl-2、caspese3陽性細(xì)胞表達(dá);(5)炎癥因子改變檢測(cè):酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)皮層、海馬和丘腦TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2炎癥因子含量;實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法測(cè)定TNF-α、IL-1β、IL-6和COX-2 m RNA表達(dá)量;(6)蛋白免疫印跡法(WB)測(cè)定MAPK通路的T-/p-JNK、ERK、p38及COX-2蛋白表達(dá)。【結(jié)果】(1)PAS-Na對(duì)染錳大鼠生長發(fā)育的影響:于染錳第三或第四周起,染錳組大鼠體重比對(duì)照組輕。亞慢性試驗(yàn)(觀察期8和12周):染錳第五和第六周,PAS預(yù)防組大鼠體重較染錳組重;PAS-Na單獨(dú)作用第三周,PAS對(duì)照組大鼠體重比對(duì)照組輕(P0.05)。亞慢性試驗(yàn)(觀察期18周)治療第五和第六周,M-和H-PAS組大鼠體重比染錳組重(P0.05);其中PAS對(duì)照組于第三周的體重比對(duì)照組輕(P0.05);除了上述時(shí)間外,PAS預(yù)防或PAS治療均對(duì)染錳大鼠體重?zé)o顯著性作用。(2)PAS-Na對(duì)染錳大鼠臟器系數(shù)的影響:觀察期4周,染錳組大鼠脾臟和腎臟系數(shù)比對(duì)照組大(P0.05);與對(duì)照組比較,染錳組大鼠心臟、肝和睪丸系數(shù)無顯著性變化(p0.05)。觀察期8周,與對(duì)照組相比,染錳組大鼠心、肝、脾和腎臟系數(shù)升高(P0.05);而PAS預(yù)防組脾臟系數(shù)比染錳組低(P0.05);PAS預(yù)防組大鼠心、肝和腎臟系數(shù)與染錳組比較無顯著性差異(P0.05)。觀察期12周,染錳組心、腎臟、睪丸和肺系數(shù)比對(duì)照組低,PAS預(yù)防組的睪丸系數(shù)比染錳組高(P0.05);PAS預(yù)防組大鼠心和腎臟系數(shù)與染錳組比較無顯著性變化(P0.05)。觀察期18周,與對(duì)照組比較,染錳組大鼠心臟和睪丸系數(shù)降低,肝臟系數(shù)升高(P0.05或0.01);與染錳組比較,H-PAS組大鼠心臟系數(shù)升高,肝臟系數(shù)減低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(3)PAS-Na對(duì)染錳大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響:各組大鼠平均逃避潛伏期均隨著測(cè)試天數(shù)的增加而減少。短期重復(fù)試驗(yàn)即觀察期4周,染錳組大鼠在測(cè)試第1、4、5天的逃避潛伏期和游泳路程比對(duì)照組長(P0.05或0.01)。觀察期8周,染錳組大鼠在測(cè)試第1、3、4、5天的平均逃避潛伏期和游泳路程較對(duì)照組長(P0.05或0.01);而PAS預(yù)防組大鼠在測(cè)試第3、4、5天平均逃避潛伏期和游泳路程較染錳組短(P0.01)。觀察期12周,染錳組大鼠在測(cè)試第2、3、4、5天的平均逃避潛伏期和游泳路程較對(duì)照組長(P0.05或0.01);而PAS預(yù)防組大鼠在測(cè)試第4和5天平均逃避潛伏期和游泳路程較染錳組短(P0.05或0.01)。觀察期18周,染錳組大鼠在測(cè)試第3、4、5天的平均逃避潛伏期和游泳路程較對(duì)照組長(P0.05或0.01);而M-PAS和H-PAS組大鼠在測(cè)試第3、4和5天平均逃避潛伏期和游泳路程較染錳組短(P0.05或0.01)。各時(shí)期的PAS-Na對(duì)照組的平均逃避潛伏期和游泳路程與對(duì)照組比較無顯著性差異(P0.05)。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后第二天,進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。觀察期4周,與對(duì)照組比較,染錳組大鼠平臺(tái)象限時(shí)間百分和穿越平臺(tái)次數(shù)降低(P0.05)。觀察期8周,染錳組大鼠平臺(tái)象限路程百分比、時(shí)間百分比和穿越平臺(tái)次數(shù)均比對(duì)照組低(P0.05或0.01);PAS預(yù)防組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)比染錳組高(P0.01)。觀察期12周,染錳組大鼠平臺(tái)象限路程百分比、時(shí)間百分比和穿越平臺(tái)次數(shù)均比對(duì)照組低(P0.01);PAS預(yù)防組大鼠平臺(tái)象限路程百分比、時(shí)間百分比和穿越平臺(tái)次數(shù)均比染錳組高(P0.05或0.01)。觀察期18周,染錳組大鼠平臺(tái)象限路程百分比、時(shí)間百分比和穿越平臺(tái)次數(shù)均比對(duì)照組低(P0.01);M-和H-PAS組大鼠平臺(tái)象限路程百分比、時(shí)間百分比和穿越平臺(tái)次數(shù)比染錳組高(P0.05或0.01)。各時(shí)期的PAS對(duì)照組大鼠的平臺(tái)象限路程百分比、時(shí)間百分比和穿越平臺(tái)次數(shù)與相應(yīng)時(shí)期的對(duì)照組比較無顯著性差異(P0.05)。各時(shí)期,各組大鼠的游泳速度無顯著性差異(P0.05)。(4)PAS-Na對(duì)染錳大鼠血錳濃度和腦錳濃度的影響:短期重復(fù)實(shí)驗(yàn)中,染錳組大鼠血錳和丘腦錳含量比對(duì)照組高(P0.05);在亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)中,觀察期8、12和18周均發(fā)現(xiàn)染錳組大鼠血錳和腦錳(皮層、海馬和丘腦)濃度均比對(duì)照組高。其中,腦錳濃度(皮層、海馬和丘腦)隨著染錳時(shí)間延長而有一定的時(shí)間反應(yīng)關(guān)系。PAS預(yù)防或治療組大鼠血錳和腦錳濃度(皮層、海馬和丘腦)濃度均低于染錳組。(5)PAS-Na對(duì)染錳大鼠皮層、海馬和丘腦GFAP陽性細(xì)胞的表達(dá)量的影響:短期重復(fù)實(shí)驗(yàn)(觀察期4周),染錳組大鼠丘腦GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)量比對(duì)照組高(P0.05)。亞慢性實(shí)驗(yàn):觀察期8周,染錳組大鼠丘腦GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)量比對(duì)照組高(P0.01);與染錳組比較,PAS預(yù)防組大鼠丘腦GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)量降低(P0.01)。觀察期12周,染錳組大鼠丘腦、海馬和皮層GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)量均比對(duì)照組高(P0.01);PAS-Na干預(yù)使染錳大鼠丘腦和皮層GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)量降低(P0.05);而對(duì)染錳大鼠海馬GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)量無影響。觀察期18周,與對(duì)照組相比,染錳組大鼠丘腦、海馬和皮層GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)量升高(P0.01);M-和H-PAS組大鼠丘腦GFAP、M-PAS組大鼠海馬GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)量比染錳組低(P0.01);PAS-Na治療對(duì)錳致大鼠皮層GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)量改變無顯著性影響(P0.05)。各時(shí)期的PAS對(duì)照組大鼠丘腦、海馬和皮層GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)量與對(duì)照組比較無顯著性差異(P0.05)。(6)PAS-Na對(duì)染錳大鼠皮層、海馬和丘腦bax、bcl-2及caspese-3陽性細(xì)胞的表達(dá)量的影響:短期重復(fù)實(shí)驗(yàn)(觀察期4周),染錳組大鼠丘腦caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)量比對(duì)照組高,bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)量比對(duì)照組低(P0.05);與對(duì)照組比較,染錳組大鼠丘腦bax陽性細(xì)胞表達(dá)量無顯著性變化,但bcl-2/bax比值比對(duì)照組低(P0.05)。觀察期8周,與對(duì)照組比較,染錳組大鼠丘腦caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)量升高,bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)量和bcl-2/bax比值降低(P0.05);與染錳組比較,PAS預(yù)防組大鼠丘腦caspase-3、bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)量和bcl-2/bax比值無明顯差異(P0.05)。觀察期12周,染錳組大鼠丘腦、海馬和皮層caspase-3及海馬bax陽性細(xì)胞表達(dá)量比對(duì)照組高,bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)量和bcl-2/bax比值比對(duì)照組低(P0.01);但染錳對(duì)大鼠丘腦和皮層bax陽性細(xì)胞表達(dá)量無影響;PAS-Na干預(yù)使大鼠丘腦和海馬caspase-3及海馬bax陽性細(xì)胞表達(dá)量降低,大鼠丘腦和海馬bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)量和bcl-2/bax比值升高(P0.05或0.01);但PAS-Na干預(yù)對(duì)染錳大鼠皮層caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)量、bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)量和bcl-2/bax比值無影響。觀察期18周,與對(duì)照組相比,染錳組大鼠丘腦、海馬和皮層caspase-3和bax陽性細(xì)胞表達(dá)量均升高,bcl-2和bcl-2/bax比值降低(P0.01);M-或H-PAS組大鼠丘腦caspase-3和bax陽性細(xì)胞表達(dá)量比染錳組低,bcl-2和bcl-2/bax比值比染錳組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05或0.01);M-和H-PAS組大鼠海馬caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)量比染錳組低(P0.05或0.01);PAS-Na治療對(duì)錳致大鼠海馬bcl-2、bax和bcl-2/bax比值改變無顯著性影響。與染錳組比較,M-或H-PAS組大鼠皮層caspase-3和bax陽性細(xì)胞表達(dá)量比染錳組低,皮層bcl-2和bcl-2/bax比值升高(P0.05或0.01);PAS對(duì)照組大鼠皮層caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)量比對(duì)照組高(P0.01,)。各時(shí)期的PAS對(duì)照組上述陽性細(xì)胞表達(dá)量與對(duì)照組比較無明顯差異。(7)PAS-Na對(duì)染錳大鼠血清、皮層、海馬和丘腦炎癥因子含量的影響:觀察期4周,染錳組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α、丘腦IL-1β和PGE2含量比對(duì)照組高(P0.05或0.01);與對(duì)照組比較,染錳組血清PGE2、丘腦TNF-α和IL-6含量無顯著性變化(P0.05)。觀察期8周,染錳組大鼠血清IL-6、IL-1β、PGE2及TNF-α、丘腦IL-1β和PGE2含量含量均比對(duì)照組高(P0.05或0.01);但染錳對(duì)丘腦TNF-α和IL-6含量無顯著性變化(P0.05);與染錳組比較,PAS預(yù)防組大鼠血清IL-1β、TNF-α、丘腦IL-1β和PGE2含量降低(P0.05);PAS預(yù)防組大鼠血清IL-6和PGE2含量與染錳組無顯著性差異(P0.05)。觀察期12周,染錳組大鼠血清、丘腦、海馬及皮層IL-1β、IL-6、PGE2和TNF-α含量均比對(duì)照組高(P0.05或0.01);PAS-Na干預(yù)使血清IL-1β和TNF-α、丘腦IL-1β和PGE2、海馬TNF-α和皮層IL-1β含量降低(P0.01)。與染錳組比較,H-PAS組大鼠海馬IL-6、IL-1β、PGE2和TNF-α含量降低(P0.05或0.01);染錳12周停止染錳6周,大鼠血清及各腦組織IL-6、IL-1β、PGE2和TNF-α含量仍比對(duì)照組高(P0.05或0.01);L-、M-和H-PAS組大鼠血清IL-1β和IL-6含量比染錳組低;與染錳組比較,M-PAS組大鼠丘腦IL-6含量和H-PAS組大鼠丘腦PGE2和TNF-α含量減低(P0.05或0.01);與染錳組比較,M-PAS組大鼠皮層IL-1β含量和H-PAS組大鼠皮層IL-6、TNF-α和PGE2含量降低(P0.05或0.01)。各時(shí)期的PAS對(duì)照組大鼠血清和各腦組織炎癥因子含量與對(duì)照組比較無顯著性差異(P0.05)。(8)PAS-Na對(duì)染錳大鼠丘腦IL-1β、IL-6、COX2和TNF-αm RNA表達(dá)的影響:染錳4周使大鼠丘腦IL-1β和COX-2 m RNA表達(dá)上調(diào),其中以COX-2 m RNA表達(dá)變化最明顯(P0.05或0.01);與對(duì)照組比較,染錳組大鼠丘腦IL-6和TNF-α表達(dá)升高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。觀察期8周,與對(duì)照組相比,染錳組大鼠丘腦IL-1β、COX-2和TNF-αm RNA表達(dá)升高(P0.05或0.01),而丘腦IL-6 m RNA無顯著性變化(P0.05);與染錳組比較,PAS預(yù)防組大鼠丘腦IL-1β和COX-2 m RNA表達(dá)降低(P0.05),而丘腦TNF-αm RNA無顯著性變化(P0.05)。觀察期12周,染錳組大鼠各腦組織(包括丘腦、海馬和皮層)IL-6、IL-1β、COX-2和TNF-αm RNA表達(dá)均比對(duì)照組高(P0.05或0.01);與染錳組比較,PAS預(yù)防組大鼠丘腦TNF-α、COX-2、海馬及皮層IL-6、IL-1β、TNF-αm RNA表達(dá)降低(P0.05),而丘腦IL-6、IL-1β、海馬及皮層COX-2 m RNA無顯著性變化(P0.05)。觀察期18周,染錳組大鼠皮層IL-6、IL-1β、TNF-α和COX-2m RNA表達(dá)仍比對(duì)照組高;染錳組大鼠丘腦IL-1β、PGE2、TNF-α、海馬IL-6、IL-1β和TNF-αm RNA比對(duì)照組高(P0.05或0.01);高劑量PAS-Na治療六周使上述錳引起上調(diào)的丘腦IL-1β、COX-2和TNF-αm RNA表達(dá)降低(P0.05);高劑量PAS-Na治療六周使上述錳引起上調(diào)的海馬IL-1β和IL-6 m RNA表達(dá)降低(P0.05);但PAS-Na治療對(duì)錳引起海馬TNF-αm RNA上調(diào)無明顯作用。高劑量PAS-Na治療六周使上述錳引起上調(diào)的皮層炎癥因子m RNA表達(dá)降低(P0.05或0.01)。各時(shí)期的PAS對(duì)照組大鼠各腦組織炎癥因子m RNA表達(dá)與對(duì)照組比較無顯著性差異(P0.05)。(9)PAS-Na對(duì)染錳引起丘腦MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)改變的影響:觀察期4周,染錳組大鼠丘腦COX-2蛋白表達(dá)、p-ERK/T-ERK、p-P38/T-P38和p-JNK/T-JNK比值升高,即染錳促進(jìn)丘腦p38、ERK和JNK的磷酸化。亞慢性毒性試驗(yàn)中,觀察期8周均觀察到染錳組丘腦COX-2蛋白表達(dá)、p-ERK/T-ERK、p-JNK/T-JNK和p-P38/T-P38比值均比對(duì)照組高(P0.05或0.01);與染錳組比較,PAS預(yù)防組JNK和p38的磷酸化降低(P0.01);但PAS-Na預(yù)防對(duì)錳致p38、EKR磷酸化和COX-2蛋白表達(dá)升高無明顯作用。觀察期12周,與對(duì)照組比較,染錳組大鼠丘腦COX-2、p-ERK、p-JNK、p-p38、海馬COX-2、p-ERK、p-p38、皮層COX-2和p-ERK蛋白表達(dá)均升高(P0.01);與染錳組比較,PAS-Na預(yù)防組大鼠丘腦、海馬和皮層COX-2表達(dá)降低(P0.05)。染錳12周停止染錳6周,染錳大鼠丘腦COX-2、p-ERK、p-JNK、p-p38、海馬COX-2、p-ERK、p-p38及皮層COX-2蛋白表達(dá)仍比對(duì)照組高(P0.05或0.01);PAS-Na治療對(duì)上述蛋白表達(dá)均有一定的拮抗作用。各個(gè)時(shí)期的PAS對(duì)照組MAPK相關(guān)蛋白和COX-2蛋白表達(dá)量與對(duì)照組比較無顯著性差異�！窘Y(jié)論】(1)染錳引起大鼠體重增長緩慢、心、腎臟、脾、睪丸和肺系數(shù)改變,PAS-Na干預(yù)和治療對(duì)染錳大鼠體重和臟器系數(shù)改變有一定程度的改善。PAS-Na對(duì)大鼠消化道有一定的影響,以至累及大鼠體重增長。(2)短期及亞慢性染錳都可影響大鼠學(xué)習(xí)能力,但其記憶功能改變僅出現(xiàn)在亞慢性錳暴露階段。PAS-Na治療或預(yù)防均可拮抗錳暴露所致的學(xué)習(xí)記憶功能改變。(3)染錳引起大鼠血錳和腦錳(皮層、海馬和丘腦)濃度升高,其中腦錳濃度隨著染錳時(shí)間延長而升高。PAS-Na干預(yù)和治療均具有促排錳作用。(4)染錳可使大鼠皮層、海馬和丘腦GFAP、Caspese-3陽性細(xì)胞的表達(dá)量升高,bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)量及bcl-2/bax比值降低;PAS-Na預(yù)防和/或治療對(duì)錳引起皮層、海馬和丘腦GFAP、Caspese-3陽性表達(dá)升高、bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)量及bcl-2/bax比值降低具有一定的拮抗作用。(5)染錳引起大鼠血清、皮層、海馬和丘腦炎癥因子含量升高及且相關(guān)的m RNA表達(dá)上調(diào)。PAS-Na預(yù)防和/或治療對(duì)錳引起血清、皮層、海馬和丘腦炎癥反應(yīng)具有一定的拮抗作用。(6)錳可能通過MAPK通路引起大鼠皮層、海馬和丘腦炎癥反應(yīng),其中以激活COX-2蛋白表達(dá)、ERK和p38磷酸化為主。PAS-Na預(yù)防和/或治療可能通過MAPK通路拮抗錳引起的大鼠皮層、海馬和丘腦炎癥反應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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1 楊宇;梁梅冰;賈真;陸冰;馮_郴，

本文編號(hào)：2005539