本文選題：三(2-氯乙基)磷酸酯 + 氧化應(yīng)激�。� 參考：《華中科技大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：三(2-氯乙基)磷酸酯(tris(2-chloroethyl) phosphate, TCEP)是一種常用的阻燃劑和增塑劑。由于TCEP以非共價鍵的方式結(jié)合在高分子材料中,因而極易逸出進入環(huán)境。目前,環(huán)境樣品(室內(nèi)空氣、飲用水和室內(nèi)灰塵等)和生物樣品(斑馬魚、海鷗和人母乳)中已檢出TCEP。實驗研究表明,TCEP有神經(jīng)毒性、生殖毒性和內(nèi)分泌毒性,并可致小鼠肝臟腫瘤。但是,TCEP致肝毒性作用的機制仍不清楚。 外源性毒物侵入機體后常誘導(dǎo)過量活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)的生成,繼而導(dǎo)致蛋白質(zhì)、DNA、多醣體和脂類等大分子物質(zhì)的損傷。線粒體是內(nèi)源性ROS產(chǎn)生與代謝的主要場所,最先受ROS攻擊,因而影響細(xì)胞的正常分裂和生長,導(dǎo)致細(xì)胞的正常生理功能發(fā)生紊亂。在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的多條信號通路中,PI3K/Akt/mTOR通路是重要的信號通路之一。P13K被ROS激活后可使膜磷酸肌醇發(fā)生磷酸化,繼而與Akt的PH區(qū)結(jié)合促發(fā)Akt磷酸化,促發(fā)Akt下游分子事件來調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂與生長。 不可逆的細(xì)胞生長阻滯是細(xì)胞衰老的重要表型。氧化應(yīng)激、線粒體損傷、端粒變短和DNA損傷等經(jīng)p53-p21-Rb信號通路、DNA損傷反應(yīng)信號通路和NFκB信號通路調(diào)控導(dǎo)致細(xì)胞衰老。本文旨在研究TCEP的肝細(xì)胞毒性、線粒體毒性以及PI3K/Akt/mTOR通路和p53-p21-Rb通路在TCEP致肝細(xì)胞生長阻滯中的調(diào)控機制,為闡明TCEP致肝毒性的分子機制提供科學(xué)依據(jù)。 第一部分TCEP致肝細(xì)胞毒性的研究 目的：研究TCEP的肝細(xì)胞毒性。 方法：用TCEP (3.12mg/L、12.50mg/L、50.00mg/L和200.00mg/L)和DMSO(終濃度0.1%,溶劑對照)分別處理張氏人肝細(xì)胞、人胚肝細(xì)胞(L02)和人肝腫瘤細(xì)胞(HepG2)24h和48h。檢測細(xì)胞活力、乳酸脫氫酶釋放率、細(xì)胞色素P450lAl和3A4酶活力、評價細(xì)胞氧化應(yīng)激(包括胞內(nèi)ROS、丙二醛、谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和還原型胱甘肽／氧化型谷胱甘肽)以及細(xì)胞增殖率、細(xì)胞周期分布和凋亡率。 結(jié)果：①TCEP處理三種細(xì)胞株24h和48h,張氏人肝細(xì)胞所有處理組的細(xì)胞活力均下降(P0.05或P0.01),但L02細(xì)胞僅有200mg/L TCEP處理組的細(xì)胞活力分別降至81.64%(P0.05)和75.80%(P0.01), HepG2細(xì)胞僅在200.00mg/LTCEP處理組細(xì)胞活力降至87.30%(P0.05)和88.49%(P0.01)：②TCEP處理張氏肝細(xì)胞24h,所有處理組細(xì)胞LDH釋放率升高(P0.05),在48h僅200mg/L TCEP的細(xì)胞LDH釋放率為0.48(P0.05)。TCEP處理L02細(xì)胞24h,所有處理組細(xì)胞LDH釋放率升高(P0.05或P0.01),在48h,≥50.00mg/L處理組細(xì)胞LDH釋放率均升高(P0.05或P0.01)。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h,所有處理組細(xì)胞LDH釋放率均升高(P0.05)),在48h,≥12.50mg.L處理組細(xì)胞LDH釋放率升高(P0.05或P0.01)：③TCEP處理張氏肝細(xì)胞24h,僅200.00mg/L處理組的胞內(nèi)ROS水平升高(P0.05)。TCEP處理L02細(xì)胞24h,僅200.00mg/L處理組的胞內(nèi)ROS水平升高(P0.05),在48h,50.00mg/L和200.00mg/L處理組的胞內(nèi)ROS水平升高(P0.05)。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h,50.00mg/L和200.00mg/L處理組胞內(nèi)ROS水平升高(P0.05),但在48h,僅200.00mg/L處理組胞內(nèi)ROS水平升高(P0.05);④TCEP處理張氏肝細(xì)胞24h和48h,≥12.50mg/L處理組GSH/GSSG比值均升高(P0.05或P0.01)。TCEP處理L02細(xì)胞24h,僅200.00mg/L處理組的GSH/GSSG比值升高(P0.05),但在48h所有處理組GSH/GSSG比值均無顯著性變化。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h和48h,所有處理組GSH/GSSG比值均升高(P0.05或P0.01);⑤TCEP處理張氏肝細(xì)胞24h≥12.50mg/L處理組的細(xì)胞增殖均受抑制(P0.05或P0.01),不過在48h則所有處理組細(xì)胞增殖均受抑制(P0.05或P0.01)。TCEP處理L02細(xì)胞24h和48h,所有處理組細(xì)胞增殖均受抑制(P0.05或P0.01)。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h和48h,僅200.00mg/L TCEP處理組細(xì)胞增殖受到抑制(P0.05)：⑥TCEP處理三個細(xì)胞株24和48h,所有處理組均未見細(xì)胞凋亡。但TCEP處理張氏細(xì)胞24h,3.12mg/L和50.00mg/L處理組細(xì)胞周期均阻滯在G2/M期(P0.05),在48h所有處理組細(xì)胞周期均阻滯在G2/M期(P0.05或P0.01)。TCEP處理L02細(xì)胞24h,3.12mg/L和200.00mg/L處理組細(xì)胞周期阻滯在G2/M期(P0.05),在48h所有處理組均未見細(xì)胞周期分布變化。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h,除200.00mg/L外,其他處理組細(xì)胞周期均阻滯在G2/M期(P0.05或P0.01),在48h僅200.00mg/L處理組細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期(P0.05)。 結(jié)論：TCEP導(dǎo)致了肝細(xì)胞氧化抗氧化失衡,抑制了細(xì)胞生長,但未致細(xì)胞凋亡。 第二部分TCEP促發(fā)線粒體信號通路致細(xì)胞生長阻滯的調(diào)控機制 目的：研究線粒體、Sirtuins及PI3K/Akt/mTOR通路在TCEP致肝細(xì)胞生長阻滯的調(diào)控機制,并揭示SIRT1在TCEP致L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞生長抑制中的調(diào)控機制。 方法：用TCEP (3.12mg/L、12.50mg/L、50.00mg/L和200.00mg/L)和DMSO(終濃度0.1%,溶劑對照)分別處理L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞24h和48h,評價細(xì)胞線粒體功能(線粒體內(nèi)ROS水平、線粒體膜電位、線粒體DNA拷貝數(shù)目、細(xì)胞內(nèi)ATP水平和胞內(nèi)游離Ca2+水平)、Sirtuins蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)水平以及PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。用SIRT1抑制劑EX-527與TCEP共處理細(xì)胞,測定細(xì)胞增殖率和PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：①TCEP分別處理L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞24h和48h,兩個細(xì)胞株的所有處理組細(xì)胞生長率均降低(P0.05或P0.01);②TCEP處理L02細(xì)胞24h,≥12.50mg/L處理組胞內(nèi)T-AOC水平均升高(P0.05或P0.01),在48h,則≥50.00mg/L處理組胞內(nèi)T-AOC水平升高(P0.05或P0.01)。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h,≥50.00mg/L處理組的胞內(nèi)T-AOC水平均升高(P0.05),在48h,≥3.12mg/L處理組胞內(nèi)T-AOC水平均升高(P0.05或P0.01)；③TCEP處理L02細(xì)胞24h和48h,僅在48h發(fā)現(xiàn)50.00mg/L和200.00mg/L TCEP處理組胞內(nèi)mtROS水平升高(P0.05,P0.01)。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h和48h,≥12.50mg/L TCEP處理組胞內(nèi)mtROS含量均升高(P0.05,P0.01);④TCEP處理L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞24h和48h,兩個細(xì)胞株所有處理組的mtDNA數(shù)目均下降(P0.05或P0.01)；⑤TCEP處理L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞24h和48h,兩個細(xì)胞株都僅在24h可見所有處理組MMP下降(P0.05或P0.01)；⑥TCEP處理L02細(xì)胞24h和48h,僅200.00mg/L處理組胞內(nèi)ATP水平降低(P0.05)。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h,50.00mg/L和200.00mg/L處理組胞內(nèi)ATP水平降低(P0.05),但在48h各處理組未見胞內(nèi)ATP水平的變化(P0.05);⑥TCEP處理L02細(xì)胞24h和48h,50.00mg/L和200.00mg/L TCEP處理組胞內(nèi)游離Ca2+水平均升高(P0.05, P0.01)。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h和48h,在24h僅200.00mg/L TCEP處理胞內(nèi)游離Ca2+水平升高(P0.05),但在48h可見50.00mg/L和200.00mg/L TCEP處理組胞內(nèi)游離Ca2+水平均升高(P0.01);⑧TCEP處理L02和HepG2細(xì)胞24h,3.12mg/L處理組SIRT1基因mRNA表達(dá)均上調(diào)(P0.05或P0.01),在48h所有處理組的SIRT1基因mRNA表達(dá)均上調(diào)(P0.05或P0.01)；⑨TCEP處理L02細(xì)胞24h和48h,所有處理組SIRT2基因mRNA表達(dá)下調(diào)(P0.05或P0.01)。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h和48h,3.12mg/L處理組SIRT2基因mRNA表達(dá)下調(diào)(P0.05或P0.01)；⑩TCEP處理L02細(xì)胞24h,所有處理組SIRT3基因mRNA表達(dá)均下調(diào)(P0.05或P0.01),在48h,3.12mg/L處理組SIRT3基因mRNA表達(dá)均下調(diào)(P0.05或P0.01)。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h,所有處理組SIRT3基因mRNA表達(dá)均下調(diào)(P0.05或P0.01),在48h,3.12mg/L處理組SIRT3基因]mRNA表達(dá)均下調(diào)(P0.05或P0.01)；11TCEP處理L02細(xì)胞24h和48h,所有處理組SIRT1蛋白表達(dá)均上調(diào),但是SIRT3蛋白表達(dá)均下調(diào),不過僅在200mg/L TCEP處理組可見SIRT2蛋白表達(dá)下調(diào)。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h和48h,所有處理組細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)均上調(diào),但SIRT3蛋白表達(dá)均下調(diào),SIRT2蛋白表達(dá)變化不明顯；12TCEP處理L02細(xì)胞24h,≥12.5mg/L處理組SIRT1蛋白表達(dá)均上調(diào)(P0.05或P0.01),在48h,所有處理組SIRT1蛋白表達(dá)均上調(diào)(P0.05或P0.01)。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h和48h,所有處理組SIRT1蛋白表達(dá)均上調(diào)(P0.05或P0.01);13TCEP處理L02細(xì)胞24h和48h,≥12.50mg/L處理組mTOR、p-mTOR、PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)均下調(diào)。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h和48h,所有處理組mTOR、p-mTOR、PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)均下調(diào)；14TCEP處理L02細(xì)胞24h,≥50.00mg/L處理組的細(xì)胞增殖受抑制(P0.05或P0.01),在48h,≥12.50mg/L處理組細(xì)胞增殖均受抑制(P0.05或P0.01)。TCEP與EX-527共處理L02細(xì)胞24h和48h,所有處理組的細(xì)胞增殖均受抑制(P0.01)。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h,≥12.50mg/L處理組細(xì)胞增殖均受抑制(P0.05或P0.01),在48h僅200.00mg/L處理組細(xì)胞增殖受抑制(P0.05)。TCEP與EX-527共處理HepG2細(xì)胞24h,≥12.50mg/L處理組細(xì)胞增殖均受抑制(P0.05或P0.01),在48h,所有處理組細(xì)胞增殖均受抑制(P0.05或P0.01);15TCEP和EX-527共處理L02細(xì)胞24h和48h,所有處理組mTOR、p-mTOR、PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)均下調(diào)。TCEP和EX-527共處理HepG2細(xì)胞24h和48h,所有處理組mTOR、p-mTOR、PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)均下調(diào)。 結(jié)論：TCEP致肝細(xì)胞線粒體損傷及線粒體功能紊亂,消弱SIRT1非依賴性PI3K/Akt/mTOR信號通路,最終導(dǎo)致肝細(xì)胞生長阻滯。 第三部分TCEP激活p53非依賴p21/Rb通路致細(xì)胞衰老樣生長阻滯的調(diào)控機制 目的：研究TCEP致肝細(xì)胞衰老及其p53-p21-Rb信號通路的調(diào)控機制。 方法：用RNA干擾技術(shù)沉默L02細(xì)胞中p53蛋白表達(dá),建立L02-p53細(xì)胞模型。用TCEP (3.12mg/L、12.50mg/L、50.00mg/L和200.00mg/L)和DMSO(終濃度0.1%,溶劑對照)分別處理L02細(xì)胞、L02-p53細(xì)胞和Hep3B(p53缺失細(xì)胞株)細(xì)胞24h和48h,對比性研究衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)陽性細(xì)胞率,IL-6分泌水平,以及p53、 MDM2、Rb、p-Rb、Ras、p2、IL6R、p38MAPK、p-p38MAPK、NFkB和p-NFkB蛋白表達(dá)。 結(jié)果：①TCEP處理L02細(xì)胞24h和48h,所有處理組的SA-β-Gal陽性細(xì)胞率升高(P0.05或P0.01)。TCEP處理L02-p53細(xì)胞24h,≥12.50mg/L處理組SA-β-Gal陽性細(xì)胞率均升高(P0.05或P0.01),在48h所有處理組SA-β-Gal陽性細(xì)胞率均升高(P0.01),陰性對照組與溶劑對照組相比無顯著性差異。TCEP處理Hep3B細(xì)胞24h和48h,所有處理組的SA-β-Gal陽性細(xì)胞率均升高(P0.05或P0.01)；②TCEP處理L02細(xì)胞24h,≥12.50mg/L處理組IL-6水平均降低(P0.05或P0.01),在48h,50.00mg/L處理組IL-6水平均降低(P0.05或P0.01)。TCEP處理L02p53-細(xì)胞24h,≥12.50mg/L處理組的IL-6水平均降低(P0.05或P0.01),在48h,≥50.00mg/L處理組IL-6水平均降低(P0.05或P0.01)。TCEP處理Hep3B細(xì)胞24h和48h,≥12.50mg/L處理組IL-6水平均降低(P0.05或P0.01)：③TCEP處理L02細(xì)胞24h和48h,所有處理組MDM2蛋白的表達(dá)均上調(diào),p53蛋白表達(dá)均下調(diào)；≥50.00mg/L處理組p38MAPK、p-p38MAPK、NFκB、p-NFκB和IL6R蛋白表達(dá)均下調(diào)；所有處理組Rb和p-Rb蛋白表達(dá)上調(diào)；≥12.50mg/L處理組p21蛋白表達(dá)均上調(diào)。TCEP處理L02-p53細(xì)胞24h和48h,≥12.50mg/L處理組p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表達(dá)均下調(diào),≥50.00mg/L處理組NFκB、p-NFκB和IL6R蛋白表達(dá)均下調(diào);所有處理組的Rb、p-Rb和p21蛋白表達(dá)均上調(diào)。TCEP處理Hep3B細(xì)胞24h和48h,≥12.50mg/L處理組p38MAPK、p-p38MAPK和IL6R蛋白表達(dá)均下調(diào)；所有處理組NFκB和P-NFκB蛋白表達(dá)均下調(diào),Rb、p-Rb和p21蛋白表達(dá)均上調(diào)。 結(jié)論：TCEP誘導(dǎo)肝細(xì)胞衰老樣生長阻滯可能由p53非依賴性p21/Rb信號通路調(diào)控。但未見IL-6/IL6R和p38MAPK/NFκB信號通路參與TCEP誘導(dǎo)肝細(xì)胞衰老樣生長阻滯。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R114

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6 張航;TCE致L-02肝細(xì)胞毒性中SET相關(guān)的表現(xiàn)遺傳調(diào)控機制的初步研究[D];深圳大學(xué);2015年

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本文編號：2003841