本文選題：鎘 + 氧化應(yīng)激��； 參考：《廣東藥科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景及目的鎘作為重要的生產(chǎn)性毒物和環(huán)境污染物,主要引起慢性腎損傷,而氧化應(yīng)激被認(rèn)為是鎘致腎氧化損傷的重要機(jī)制。不少研究表明,鎘可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生過量ROS,使氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡,最終導(dǎo)致各系統(tǒng)氧化損傷。鎘可通過以下途徑對(duì)腎臟產(chǎn)生氧化損傷:(1)降低機(jī)體抗氧化能力。鎘可以與超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽還原酶(GSSG-R)的巰基結(jié)合,與谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)中的硒(Se)形成Cd-Se復(fù)合物,并能降低內(nèi)源性抗氧化物谷胱甘肽(GSH)的水平,從而使這些酶的抗氧化活力降低或喪失。(2)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生過量自由基,使細(xì)胞氧化/抗氧化水平失衡。在細(xì)胞呼吸過程中,鎘可以損傷線粒體,協(xié)同銅和鐵離子產(chǎn)生氧自由基;2價(jià)鎘離子與DNA結(jié)合蛋白“鋅指”結(jié)構(gòu)中的鋅離子發(fā)生置換,產(chǎn)生自由基;鎘也可以通過活化血紅素氧化酶、黃嘌呤氧化酶使機(jī)體產(chǎn)生過量的超氧自由基。(3)鎘可以引起炎癥反應(yīng),活化的炎癥細(xì)胞可以釋放多種細(xì)胞因子,從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生氧化損傷。鎘通過上述途徑產(chǎn)生的氧自由基,可引起細(xì)胞DNA氧化損傷,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要亞細(xì)胞器之一,其主要功能是使蛋白質(zhì)合成和被修飾與加工后,正確折疊、組裝和運(yùn)輸。當(dāng)細(xì)胞受到體內(nèi)外氧化應(yīng)激后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)將產(chǎn)生未折疊蛋白/錯(cuò)誤折疊蛋白積聚,誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生不同程度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)。最近有報(bào)道認(rèn)為,鎘誘導(dǎo)細(xì)胞ROS的生成可觸發(fā)ERS反應(yīng)。但鎘是如何通過ROS誘導(dǎo)腎細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,其機(jī)制仍需深入探討。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)信號(hào)通路是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的中樞調(diào)節(jié)者,可以有效清除自由基、對(duì)抗致癌中間物、參與抗氧化蛋白酶的表達(dá)與調(diào)控,在細(xì)胞介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激防御反應(yīng)中具有重要的作用。在鎘誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生過量自由基而導(dǎo)致氧化損傷的過程中,過量自由基可觸發(fā)細(xì)胞Nrf2信號(hào)通路介導(dǎo)的抗氧化機(jī)制以及抑制細(xì)胞的炎癥通路的啟動(dòng),可以有效清除自由基、促進(jìn)DNA損傷修復(fù)、對(duì)抗致癌中間物、參與抗氧化蛋白酶及Ⅱ相代謝酶基因的表達(dá)與調(diào)控,在鎘暴露導(dǎo)致的腎臟損傷中具有重要的拮抗作用�？墒�,在鎘毒性作用下,Nrf2信號(hào)通路的具體調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。近年來,有研究提出,Nrf2信號(hào)通路可被未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response,UPR)激活,Nrf2作為蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)的底物可被PERK磷酸化,從而實(shí)現(xiàn)跨核膜轉(zhuǎn)運(yùn)并與抗氧化反應(yīng)元件(Antioxidant response element,ARE)結(jié)合,啟動(dòng)Nrf2-ARE信號(hào)通路。但研究在鎘致人腎細(xì)胞毒性作用中ERS和Nrf2之間的相互調(diào)控機(jī)制卻報(bào)道甚少。目前,關(guān)于鎘對(duì)ERS和Nrf2信號(hào)通路的影響及其調(diào)控作用研究基本上都是基于動(dòng)物和細(xì)胞的研究,而通過工人的研究來探討鎘對(duì)職業(yè)作業(yè)工人ERS和Nrf2信號(hào)通路的影響,國內(nèi)外尚未見報(bào)道。因此,本研究先選擇職業(yè)鎘暴露工人,觀察鎘對(duì)工人腎功能損傷、氧化應(yīng)激、ERS和Nrf2的影響;再通過建立HEK細(xì)胞鎘中毒模型,檢測細(xì)胞存活率、氧化應(yīng)激、ERS和Nrf2相關(guān)基因與蛋白表達(dá)的變化,以揭示鎘對(duì)氧化損傷、ERS與Nrf2影響的分子毒理學(xué)機(jī)制;最后應(yīng)用ERS、Nrf2的誘導(dǎo)劑與抑制劑,從正反兩方面來探討鎘毒作用過程中ERS和Nrf2信號(hào)通路的相互調(diào)控機(jī)制,從而為深入研究鎘毒作用機(jī)制以及鎘中毒的防治提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。方法1實(shí)驗(yàn)方法1.1人群實(shí)驗(yàn)方法1.1.1樣品的采集與處理選擇34名職業(yè)鎘作業(yè)工人,按《工作場所有害物質(zhì)監(jiān)測方法》對(duì)工人進(jìn)行尿、血樣的采集,樣品收集后,貼上受檢人員姓名、編號(hào)、日期等標(biāo)簽,放置于4℃的冰箱內(nèi)立即送檢,-20℃冰箱保存待檢。1.1.2指標(biāo)的測定應(yīng)用石墨爐原子吸收法對(duì)尿、血鎘進(jìn)行檢測;采用羥胺法、酶促反應(yīng)法和硫代巴比妥酸比色法測定氧化應(yīng)激指標(biāo);采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法和可見分光光度計(jì)比色法檢測尿β2-微球蛋白(β2-MG)含量和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)活力、尿肌酐;采用全自動(dòng)生化鑒定儀對(duì)尿白蛋白(ALB)含量、血尿酸和血尿素氮指標(biāo)進(jìn)行檢測;采用酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)8-OHd G、PERK和Nrf2含量進(jìn)行測定。1.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法1.2.1實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)1.2.1.1對(duì)照組:加入等體積無Cd Cl2的10%DMEM培養(yǎng)基。1.2.1.2氯化鎘(Cd Cl2)單獨(dú)作用組:用濃度為2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L的Cd Cl2溶液染毒HEK細(xì)胞24h、48h和72h。。1.2.1.3 ERS增強(qiáng)劑桿菌肽預(yù)處理組:應(yīng)用0.5 mmol/L桿菌肽預(yù)處理12h后,加入濃度為2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L的Cd Cl2溶液染毒細(xì)胞24h、48h和72h。1.2.1.4 ERS阻滯劑牛磺脫氧膽酸(TUDCA)預(yù)處理組:用50μmol/L TUDCA預(yù)處理12h后,加入濃度為2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L的Cd Cl2溶液染毒細(xì)胞24h、48h和72h。1.2.1.5 Nrf2誘導(dǎo)劑叔丁基對(duì)苯二酚(t BHQ)預(yù)處理組:用50μmol/L t BHQ預(yù)處理12h后,加入濃度為2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L的Cd Cl2溶液染毒細(xì)胞24h、48h和72h。1.2.1.6 Nrf2抑制劑木犀草素(Luteolin)預(yù)處理組:用10μmol/L Luteolin預(yù)處理12h后,加入濃度為2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L的Cd Cl2溶液染毒24h、48h和72h。1.2.2 HEK細(xì)胞增殖活性測定以濃度為2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L的Cd Cl2溶液染毒HEK細(xì)胞24h、48h和72h后,用噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測細(xì)胞的增殖活性情況。1.2.3 HEK細(xì)胞氧化應(yīng)激水平測定以濃度為2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L的Cd Cl2溶液染毒HEK細(xì)胞24h、48h和72h后,測定HEK細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、丙二醛(MDA)與8-羥基脫氧鳥苷(8-OHd G)含量反映細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。1.2.4 HEK細(xì)胞基因表達(dá)測定將細(xì)胞接種于6cm培養(yǎng)皿中,按1.2.1實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞,用RNAiso Plus試劑提取細(xì)胞總RNA,采用q RT-PCR法檢測各組細(xì)胞內(nèi)ERS與Nrf2信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)。1.2.5 HEK細(xì)胞蛋白翻譯測定將細(xì)胞接種于10cm培養(yǎng)皿中,按1.2.1實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞,按Nuc Buster TM Protein Extraction Kit試劑盒說明書提取漿蛋白和核蛋白,蛋白定量后用Western blotting技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)Bip、PERK和Nrf2蛋白的翻譯水平。2統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)服從正態(tài)分布者,以(?)±s描述。滿足正態(tài)性分布且方差齊的兩組之間差異的比較用兩組獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),多組均數(shù)間顯著性差異檢驗(yàn)采用單因素方差分析,組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)法,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果1鎘對(duì)工人氧化應(yīng)激、ERS與Nrf2的影響1.1工人尿、血鎘含量的分析在工人沒有慢性輕度鎘中毒的前提下,女工的尿鎘含量水平顯著高于男工(P0.05);隨年齡的增長,30~57歲年齡階段的工人血鎘含量水平有逐漸下降趨勢;工齡超過10年的工人尿鎘含量有所增高,說明暴露在鎘作業(yè)環(huán)境的時(shí)間越長,鎘在體內(nèi)蓄積得越多,因此尿液中鎘含量較高。年齡、工齡兩因素分別與尿鎘、血鎘之間均不存在相關(guān)性,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。1.2鎘對(duì)工人腎功能損傷的影響在各尿、血鎘水平條件下,工人尿β2-MG、ALB含量、NAG活力與血尿酸、尿素氮含量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的改變(P0.05),表明在各尿、血鎘水平條件下,鎘沒有引起工人腎功能損傷的改變。1.3鎘對(duì)工人氧化應(yīng)激的影響較小于3μg/L和大于5μg/L血鎘水平,在3~5μg/L血鎘水平條件下,工人體內(nèi)抗氧化酶SOD與GSH-Px活性顯著地增高(P0.05),而脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA與DNA氧化修飾產(chǎn)物8-OHd G的含量明顯地降低(P0.05)。1.4鎘對(duì)工人ERS和Nrf2的影響與小于3μg/L和大于5μg/L血鎘水平比較,在3~5μg/L血鎘水平條件下,PERK和Nrf2蛋白含量顯著地升高(P0.05)。說明在3~5μg/L血鎘水平條件下,鎘可誘導(dǎo)工人ERS反應(yīng)與Nrf2轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。1.5不同性別對(duì)工人腎功能損傷的影響與男工比較,女工尿β2-MG、ALB、NAG以及血尿酸、尿素氮均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的改變(P0.05)。說明性別的差異對(duì)腎功能損傷沒有影響。1.6不同性別對(duì)工人氧化應(yīng)激的影響男女工人體內(nèi)抗氧化酶SOD和GSH-Px活力水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變化(P0.05)。體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA與DNA氧化修飾產(chǎn)物8-OHd G含量,男女之間也無差異(P0.05)。表明鎘在男女工人體內(nèi)蓄積雖有不同,但并沒有引起氧化應(yīng)激反應(yīng)。1.7不同性別對(duì)工人ERS和Nrf2的影響工人體內(nèi)PERK蛋白與Nrf2蛋白含量在不同性別之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的改變(P0.05)。表明性別對(duì)ERS反應(yīng)與Nrf2沒有影響。2鎘對(duì)HEK細(xì)胞ERS與Nrf2信號(hào)通路的影響2.1鎘對(duì)HEK細(xì)胞增殖活性的影響在2.5~20.0μmol/L劑量條件下作用24、48與72h,隨著染鎘濃度的增高與作用時(shí)間的延長,HEK細(xì)胞相對(duì)存活率逐漸降低。表明HEK細(xì)胞的增殖活性受鎘的抑制。2.2鎘對(duì)HEK細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響鎘在2.5~20.0μmol/L劑量條件下作用24、48與72h,隨著染鎘濃度的增加與作用時(shí)間的延長,HEK細(xì)胞脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA與DNA氧化修飾產(chǎn)物8-OHd G含量有逐漸升高趨勢,但抗氧化酶SOD和GSH-Px活性呈逐漸降低趨勢。說明鎘誘導(dǎo)HEK細(xì)胞氧化損傷產(chǎn)物的形成,同時(shí)也抑制抗氧化酶活性,導(dǎo)致氧化損傷的加重,這可能與其抑制HEK細(xì)胞增殖活性有關(guān)。2.3鎘對(duì)HEK細(xì)胞ERS的影響在鎘毒性作用下,HEK細(xì)胞Bip、PERK m RNA與蛋白、ATF4 m RNA表達(dá)有不同程度的變化,且鎘在10.0、20μmol/L劑量條件下作用72h,可顯著上調(diào)Bip、PERK m RNA與蛋白、ATF4 m RNA的表達(dá)(P0.05)。2.4鎘對(duì)HEK細(xì)胞Nrf2信號(hào)通路的影響鎘在2.5~20.0μmol/L條件下作用48h與72h,Nrf2 m RNA與蛋白表達(dá)隨染毒劑量增加而逐漸上升。故隨劑量增高,鎘觸發(fā)ERS反應(yīng)增強(qiáng)的同時(shí),也誘導(dǎo)了Nrf2 m RNA與蛋白表達(dá)的上調(diào)。此外,鎘在20.0μmol/L條件下作用48h,可顯著上調(diào)Nrf2 m RNA與蛋白及其介導(dǎo)的下游Ⅱ相解毒酶基因的表達(dá),說明鎘可誘導(dǎo)Nrf2信號(hào)通路介導(dǎo)的Ⅱ相解毒酶基因表達(dá)的上調(diào)。3 ERS與Nrf2信號(hào)通路在鎘致HEK細(xì)胞氧化損傷中的相互調(diào)控作用3.1鎘誘導(dǎo)HEK細(xì)胞ERS對(duì)Nrf2信號(hào)通路的調(diào)控作用3.1.1 ERS增強(qiáng)對(duì)染鎘HEK細(xì)胞ERS和Nrf2相關(guān)基因和蛋白表達(dá)影響經(jīng)桿菌肽預(yù)處理后,鎘在2.5~20.0μmol/L劑量條件下作用24h、48h與72h,隨染毒劑量增加與作用時(shí)間延長,Nrf2表達(dá)隨ERS相關(guān)分子表達(dá)總體上有逐漸上升趨勢,其中,與同組對(duì)照組比較,桿菌肽+各劑量Cd Cl2組相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平多上調(diào);與相同劑量單染鎘組比較,桿菌肽+各劑量Cd Cl2組Bip、PERK、Nrf2 m RNA和蛋白表達(dá)均顯著升高(P0.05)。故ERS的增強(qiáng)可誘導(dǎo)Nrf2表達(dá)上調(diào)。3.1.2 ERS阻滯對(duì)染鎘HEK細(xì)胞ERS和Nrf2相關(guān)基因和蛋白表達(dá)影響經(jīng)TUDCA預(yù)處理后,鎘在2.5~20.0μmol/L劑量條件下作用24h、48h與72h,隨染毒劑量增加與作用時(shí)間延長,Nrf2表達(dá)隨ERS相關(guān)分子表達(dá)總體上有逐漸升高趨勢,其中,與同組對(duì)照組比較,TUDCA+各劑量Cd Cl2組相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平均升高;與相同劑量單染鎘組比較,TUDCA+各劑量Cd Cl2組Bip、PERK、Nrf2 m RNA和蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)(P0.05)。故ERS的抑制可誘導(dǎo)Nrf2表達(dá)下調(diào)。3.2 Nrf2對(duì)鎘誘導(dǎo)HEK細(xì)胞ERS的反饋調(diào)節(jié)作用3.2.1 Nrf2誘導(dǎo)對(duì)染鎘HEK細(xì)胞ERS和Nrf2相關(guān)基因和蛋白表達(dá)影響經(jīng)t BHQ預(yù)處理后,鎘在2.5~20.0μmol/L劑量條件下作用24h、48h與72h,隨染毒劑量增加與作用時(shí)間延長,Nrf2表達(dá)和ERS相關(guān)分子表達(dá)總體上有逐漸上升趨勢,其中,與同組對(duì)照組比較,t BHQ+各劑量Cd Cl2組相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平均有不同程度的升高;與相同劑量單染鎘組比較,t BHQ+鎘在2.5~20.0μmol/L劑量條件下作用24h,Nrf2漿蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P0.05),漿核比無顯著改變,但Bip、PERK m RNA和蛋白表達(dá)水平有所上升。說明t BHQ可上調(diào)Nrf2 m RNA和蛋白表達(dá),而下調(diào)Bip、PERK m RNA和蛋白表達(dá)。故在一定程度上,經(jīng)PERK-Nrf2信號(hào)途徑介導(dǎo)的Nrf2信號(hào)通路的激活可緩解ERS反應(yīng)。3.2.2 Nrf2抑制對(duì)染鎘HEK細(xì)胞ERS和Nrf2相關(guān)基因和蛋白表達(dá)影響經(jīng)Luteolin預(yù)處理后,鎘在2.5~20.0μmol/L劑量條件下作用24h、48h與72h,隨染毒劑量增加與作用時(shí)間延長,Nrf2表達(dá)和ERS相關(guān)分子表達(dá)總體上有逐漸上升趨勢。其中,與同組對(duì)照組比較,Luteolin+各劑量Cd Cl2組Nrf2、Bip、PERK基因和蛋白表達(dá)水平均有不同程度的升高,而Luteolin+鎘在2.5~20.0μmol/L劑量條件下作用48h與72h,漿核比顯著上升(P0.05);與相同劑量單染鎘組比較,Luteolin+各劑量Cd Cl2組Nrf2、PERK基因和蛋白表達(dá)水平有所下降,但Bip基因和蛋白表達(dá)有所上升。表明Luteolin抑制PERK介導(dǎo)的Nrf2后,可引起ERS標(biāo)志性分子Bip的過表達(dá)。結(jié)論1在沒有慢性輕度鎘中毒的前提下,鎘未引起工人腎功能損傷的改變,但較小于3μg/L和大于5μg/L的血鎘濃度,在3~5μg/L血鎘水平條件下,鎘觸發(fā)了工人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),并通過激活PERK介導(dǎo)的Nrf2轉(zhuǎn)錄因子,誘導(dǎo)其下游抗氧化酶活性的升高,從而抑制了氧化損傷產(chǎn)物的生成,最終起到抗氧化作用;雖然鎘在女工體內(nèi)蓄積水平較高,但未引起腎功能、氧化應(yīng)激、ERS與Nrf2的改變。2鎘在一定劑量條件下作用一定時(shí)間,可誘導(dǎo)HEK細(xì)胞氧化損傷產(chǎn)物的生成,并抑制抗氧化酶活性,兩者共同作用導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷的加重,這可能與其抑制HEK細(xì)胞增殖活性有關(guān);在鎘毒作用過程中,HEK細(xì)胞可通過PERK-Nrf2信號(hào)途徑激活Nrf2,上調(diào)其下游Ⅱ相解毒酶基因的表達(dá);在應(yīng)用桿菌肽、TUDCA使ERS增強(qiáng)與阻滯后,ERS可正向調(diào)節(jié)Nrf2的表達(dá);而在應(yīng)用t BHQ、Luteolin誘導(dǎo)與抑制Nrf2表達(dá)后,Nrf2可反饋性地調(diào)節(jié)ERS反應(yīng)的強(qiáng)度。3本研究通過開展鎘暴露的分子流行病學(xué)和分子毒理學(xué)研究,揭示了鎘引起作業(yè)工人和HEK細(xì)胞氧化應(yīng)激時(shí),對(duì)ERS和Nrf2信號(hào)通路的作用及其調(diào)控機(jī)制,不僅豐富了鎘的毒理學(xué)機(jī)制,而且為鎘職業(yè)中毒的防治提供了學(xué)術(shù)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1998671