本文選題：氧化石墨烯 + 神經(jīng)干細(xì)胞��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2013年碩士論文

【摘要】：目的： 氧化石墨烯（graphene oxide，GO）是石墨烯經(jīng)氧化處理后的衍生物，大小在十納米到幾百納米乃至微米不等，在水中有很好的穩(wěn)定性，表面分布有大量的羥基、環(huán)氧基，邊緣分布有羧基和羰基等含氧活性基團(tuán)[1,2]，有較高的熒光猝滅效率以及超強(qiáng)的吸附能力。這些獨(dú)特的理化性質(zhì)特別有利于對GO的表面修飾和功能化，以實現(xiàn)對藥物的靶向裝載和緩釋作用等多種功能。因此GO在腫瘤的靶向治療，細(xì)胞成像，生物傳感器，生物檢測等方面，顯示了不可估量的應(yīng)用前景[3-8]，深受生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的青睞。 納米技術(shù)在給人類帶來巨大利益的同時，也可能給人類及生態(tài)系統(tǒng)帶來潛在的危險。這些納米級的極小顆粒，容易進(jìn)入生物體內(nèi)，像小分子一樣在身體各部分間自由穿梭，快速分布于除大腦以外的身體各器官組織中[9]，并與組織、細(xì)胞、細(xì)胞器和蛋白質(zhì)等生物大分子相互作用，造成組織或細(xì)胞的功能異常，影響生物體的健康。也有研究發(fā)現(xiàn)，納米材料還可以穿透血腦屏障。Kreuter等[10]發(fā)現(xiàn)，靜脈注射聚山梨酯-80包裹的阿霉素納米顆粒，可以被大腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞吞噬后穿透大鼠BBB。Oberd rster等[11]也證實，納米材料也可以通過嗅神經(jīng)通路進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)或者經(jīng)感覺神經(jīng)末梢直接轉(zhuǎn)運(yùn)至腦內(nèi)。進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)的納米顆粒，還可以激活小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生ROS，誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)，誘發(fā)神經(jīng)毒性致使神經(jīng)組織損傷。CNS是機(jī)體最重要的器官，它整合全身各組織器官的信息，調(diào)控著機(jī)體生理活動以及腦的高級活動。所以納米材料對神經(jīng)系統(tǒng)的生物安全性的評價有非常重要的臨床意義，，也在很大程度上決定納米材料的應(yīng)用前景。 GO進(jìn)入體內(nèi)后，能否通過血腦屏障，對神經(jīng)系統(tǒng)有何影響未見相關(guān)報道。因此本研究將通過體內(nèi)外實驗綜合評價100～500nm大小的GO對神經(jīng)系統(tǒng)的影響，為GO在多領(lǐng)域的應(yīng)用提供客觀和科學(xué)的實驗依據(jù)。 第一部分：GO對SD大鼠的體內(nèi)神經(jīng)毒性研究 方法： 1GO表征鑒定 1.1高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）觀察GO的表面特征。 1.2raman光譜檢測GO表面基團(tuán)。 1.3紫外掃描觀察GO的吸收峰。 2動物實驗 32只健康清潔級SD雄性大鼠（周齡4~5w，體重95±10g），隨機(jī)分為對照組（生理鹽水），2.5，5和10mg/kg/d體重3個GO實驗組，8只/組，尾靜脈注射GO到SD大鼠體內(nèi)，1次/d，連續(xù)注射5d，休息2d，以測試動物的檢測指標(biāo)。連續(xù)注射4周，水迷宮實驗后處死動物。實驗期間分別觀察并記錄： 2.1一般情況：檢測動物活動情況、精神狀況，每日食物消耗量及體重變化。 2.2尾靜脈給GO前以及第7d、14d、21d、28d，分別測試實驗動物： Open-Field實驗：以觀察實驗動物的神經(jīng)精神活動； 功能觀察組合實驗（FOB）：綜合評價實驗動物的神經(jīng)主動運(yùn)動行為、中樞神經(jīng)系統(tǒng)活動、中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性、神經(jīng)肌肉反應(yīng)、感覺運(yùn)動功能。 2.3實驗第29d，Morris水迷宮檢測實驗動物的學(xué)習(xí)記憶以及空間探索功能。 2.4水迷宮實驗后，取實驗動物的大腦、小腦、坐骨神經(jīng)及脊髓腰膨大，固定、包埋、切片、染色，光學(xué)及透射電子顯微鏡下行組織病理學(xué)觀察。 結(jié)果： 1.大鼠一般狀況良好，無死亡和疾病發(fā)生，各劑量組每日食物消耗量、體重變化均無顯著性差異（p＞0.05）。 2. Open-Field實驗中：各組實驗動物的水平運(yùn)動和垂直運(yùn)動得分均無明顯差異（p＞0.05）。 3. FOB綜合實驗中：各組實驗動物的①一般活動及神經(jīng)肌肉測試；②感覺運(yùn)動及興奮性測試；③自主性活動測試各指標(biāo)間均無明顯差異（p＞0.05）。 4. Morris水迷宮實驗中，大鼠的逃避潛伏期及游泳距離與對照組相比均無顯著性差異（p＞0.05），在原平臺象限的游泳時間、原平臺象限游程百分比以及穿越平臺次數(shù)均無顯著性差異（p＞0.05）。 5.形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：TEM及光學(xué)顯微鏡下，大腦皮層、海馬神經(jīng)元、小腦、坐骨神經(jīng)及脊髓腰膨均未見GO的顆粒存在，也未見明顯的組織病理學(xué)改變。 結(jié)論： 中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)中未見GO的顆粒存在，提示GO不能通過血腦及血腦脊液屏障，因此對實驗大鼠的： 1.生長發(fā)育、神經(jīng)精神狀況、運(yùn)動、感覺均沒有明顯影響。 2.學(xué)習(xí)記憶以及空間探索功能沒有明顯影響。 3.中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)也未見明顯的組織病理學(xué)改變。 第二部分：GO對神經(jīng)干細(xì)胞和海馬神經(jīng)元的影響 方法： 1. GO的鑒定同上。 2.取SD孕鼠原代培養(yǎng)的二代神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）或培養(yǎng)6~7d的海馬神經(jīng)元接種于6孔或96孔板中，隨機(jī)將其分為6組，即對照組（培養(yǎng)液中不加任何刺激因素），10,25,50,100和200μg/mL GO實驗組，分別在培養(yǎng)液中加相應(yīng)終濃度GO；作用24h或120h。 實驗觀察： 1.培養(yǎng)期間倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)特征。 2.培養(yǎng)24h或120h后： TEM觀察NSCs及海馬神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)； MTT法檢測NSCs及海馬神經(jīng)元的細(xì)胞存活率； 臺盼藍(lán)排斥實驗檢測細(xì)胞死亡率； 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)ROS水平； LDH水平檢測評估細(xì)胞膜的完整性。 結(jié)果： 1.細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)：與對照組相比，GO實驗組NSCs及海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)均正常。 2.細(xì)胞存活率：GO作用NSCs及神經(jīng)元24h或120h，GO實驗組細(xì)胞的存活率與相應(yīng)對照組相比均無顯著差異（p＞0.05）。 3.細(xì)胞死亡率：GO作用NSCs及神經(jīng)元24h或120h后，GO實驗組細(xì)胞死亡率與相應(yīng)對照組均無顯著性差異（p＞0.05）。 4.細(xì)胞膜完整性：GO作用NSCs及神經(jīng)元24h或120h，GO實驗組LDH漏出與相應(yīng)對照組相比均無顯著差異（p＞0.05）。 5.細(xì)胞凋亡：GO作用NSCs及神經(jīng)元24h或120h，GO實驗組細(xì)胞的凋亡或死亡與相應(yīng)對照組相比無顯著差異（p＞0.05）。 6.細(xì)胞內(nèi)ROS檢測：GO作用NSCs及神經(jīng)元24h或120h，GO實驗組細(xì)胞內(nèi)ROS水平與相應(yīng)對照組相比無顯著差異（p＞0.05）。 結(jié)論： GO直接作用NSCs及海馬神經(jīng)元24h或120h均未引起明顯的細(xì)胞毒性效應(yīng)，其潛在的機(jī)制可能是：GO沒有進(jìn)入NSCs及神經(jīng)元，也沒有誘導(dǎo)細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，提示GO與CNS具有良好的生物相容性。 結(jié)合體內(nèi)外實驗，我們認(rèn)為GO對神經(jīng)系統(tǒng)可能具有良好的生物相容性，對神經(jīng)系統(tǒng)是安全的納米材料。
[Abstract]:Objective:
Graphene oxide (GO) is a derivative of graphene after oxidation treatment. The size ranges from ten nanometers to hundreds of nanometers and even microns. It has a good stability in water. The surface has a large number of hydroxyl groups, epoxy groups, the distribution of carboxyl and carbonyl groups, such as [1,2], with high fluorescence quenching efficiency and excess. These unique physical and chemical properties are particularly beneficial to the surface modification and functionalization of GO, so as to achieve the target loading and sustained release of drugs, so GO has shown an immeasurable application prospect, [3-8], in the tumor targeting therapy, cell imaging, biosensor, biological detection and so on, and is deeply affected by biological medicine. The favor of the field of learning.
Nanotechnology, while bringing great benefits to human beings, can also bring potential hazards to humans and ecosystems. These nanoscale tiny particles are easily accessible to organisms, like small molecules, freely shuttle between parts of the body, fast distributed in the tissues of the body except the brain, [9], and tissue, cells, and cells. Biological macromolecules such as organelles and proteins interact with each other, causing abnormal function of tissues or cells and affecting the health of organisms. Some studies have also found that nanomaterials can also penetrate the [10] of the blood brain barrier.Kreuter and so on. The doxorubicin nanoparticles encapsulated by polysorbate -80 can be phagocytic after phagocytosis of cerebral capillary endothelial cells. [11], which penetrates the rat BBB.Oberd rster, also confirms that nanomaterials can also enter the central nervous system or transshipment directly into the brain through the olfactory nerve pathway. The nanoparticles entering the nervous system can also activate the microglia to produce ROS, induce oxidative stress, inflammation, and induce neurotoxicity. Tissue injury.CNS is the most important organ of the body. It integrates the information of all organs and organs of the body, regulates the physiological activities of the body and the advanced activities of the brain. Therefore, the evaluation of the biosafety of the nervous system by nano materials has very important clinical significance, and it also determines the prospect of the application of nanomaterials to a great extent.
When GO enters the body, there is no related report on whether the blood brain barrier can affect the nervous system. Therefore, this study will evaluate the effects of 100 ~ 500nm of GO on the nervous system through the experiment in vitro and in vivo, and provide an objective and scientific basis for the application of GO in many fields.
Part one: the neurotoxicity of GO on SD rats
Method錛

本文編號：1920982