本文選題：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 + 淋巴細(xì)胞��； 參考：《華中科技大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：霉菌毒素(Mycotoxin, MYO)是由霉菌或真菌產(chǎn)生的有毒有害的二級代謝產(chǎn)物。在土壤中、植物上、谷物、飼草和青貯飼料等均可發(fā)現(xiàn)霉菌毒素。霉菌毒素可在農(nóng)作物收獲時形成。在不適宜的貯存條件下,霉菌毒素也可繼續(xù)在收獲后的農(nóng)作物上形成。世界上每年大約有25%谷物遭受各種霉菌污染,因污染程度不同,不同地區(qū)差距很大,而中國是霉菌毒素污染的重災(zāi)區(qū)之一。 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol, DON)又稱嘔吐毒素(Vomitoxin),它能夠?qū)θ梭w健康造成極大的傷害。它主要是由鐮刀菌的某些種菌產(chǎn)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性相似的有毒代謝產(chǎn)物——單端孢霉烯族化合物中的一種。DON的主要產(chǎn)生菌是禾谷鐮刀菌(Fusarium Graminearum),據(jù)報道也有其它一些鐮刀菌可產(chǎn)生。DON屬于劇毒類,以往的研究中表明：DON在體內(nèi)可能有一定的蓄積,且具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性,但無特殊的靶器官。人畜誤食了被DON污染的食物/飼料后,會導(dǎo)致厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)、反應(yīng)遲鈍等急性中毒癥狀,嚴(yán)重時會損害造血系統(tǒng)造成死亡。 目前,在食品安全和基礎(chǔ)毒理學(xué)研究(致畸)中也發(fā)現(xiàn),DON能夠在很多的食品中以極低的含量檢測出。如大、小麥制品可檢出1 ppm的DON含量、4月齡雞肉中可檢測出10ppm的DON含量,豬肉中可檢出5ppm的DON含量以及酒類中均能檢測出DON的存在。毒理學(xué)研究指出：100 ng/mL的DON能導(dǎo)致細(xì)胞分裂指數(shù)下降、細(xì)胞炎性物質(zhì)過度表達(dá)和細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的情況。低劑量的DON能造成V79細(xì)胞出現(xiàn)微核及染色體畸變；經(jīng)口灌服(1000 mg/kg)能致使胎鼠和仔雞的骨骼畸形和小鼠生殖細(xì)胞數(shù)量下降以及細(xì)胞形態(tài)發(fā)生畸形。綜上所述,不同劑量的DON能致使動物臟器和細(xì)胞受到不同程度的損傷,特別是生殖細(xì)胞的數(shù)量和活力的下降,這也提示了,DON可能具有潛在的細(xì)胞毒性和遺傳毒性。然而,迄今為止,文獻(xiàn)中關(guān)于DON對人原代細(xì)胞是否有遺傳毒性和其毒性的分子毒理學(xué)的研究還比較少。 因此,本研究的目的在于：利用人外周血淋巴細(xì)胞作為實驗對象,觀察DON對人原代細(xì)胞的細(xì)胞毒性和遺傳毒性。并利用分子生物學(xué)技術(shù)對細(xì)胞毒性和遺傳毒性進(jìn)行分子層面的研究。 第一部分 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇導(dǎo)致人外周血淋巴細(xì)胞的遺傳毒性研究 目的：以人外周血淋巴細(xì)胞為研究對象,觀察DON對人淋巴細(xì)胞的細(xì)胞活力抑制作用(IC50)、對人淋巴細(xì)胞DNA的損傷作用,以及對人淋巴細(xì)胞染色體損傷的作用。 方法： (1)志愿者均為健康人員,血樣采集前需經(jīng)過知情同意書的填寫和個人健康狀況的詢問,包括：是否在近期接受過藥物治療、是否有遺傳病和傳染病以及是否有不良嗜好(抽煙或酗酒)等。 (2)全血樣本用淋巴細(xì)胞分離液分離提取淋巴細(xì)胞,隨后用PRMI 1640培養(yǎng)液重懸,并接種于細(xì)胞培養(yǎng)板。 (3)利用CCK-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽)試劑盒檢測細(xì)胞活力,并計算IC50數(shù)值。 (4)利用單細(xì)胞凝膠電泳法,檢測DON對淋巴細(xì)胞DNA的損傷程度。 (5)在微核試驗中利用細(xì)胞松弛素-B阻滯法檢測DON暴露下的淋巴細(xì)胞微核的產(chǎn)生情況。 (6)利用姐妹染色體交換法,觀察DON造成人淋巴細(xì)胞染色體損傷的程度。 結(jié)果： (1)在染毒DON 24 h后,細(xì)胞活力從98.07±0.10%(0 ng/mL DON)下降到14.03±1.78% (500 ng/mL DON)(P0.01)。兩性細(xì)胞樣本的IC50為：男---103.7±2.83 ng/mL；女---101.4±3.15 ng/mL,男性樣本和女性樣本的IC50之間無性別差異(P0.05)。 (2)在染毒24 h后,與陰性對照組相比,DON組的Tail length、Tail DNA%和Tail moment的數(shù)值明顯增加(P0.01)。 (3)微核試驗的結(jié)果顯示,DON的暴露能明顯增加人淋巴細(xì)胞中微核的數(shù)量。染毒組微核數(shù)量明顯高于陰性對照組(23.86±4.11‰,0 ng/mL DON vs 109.66±9.81‰,50 ng/mL DON,24 h,P0.01). (4)姐妹染色體交換的結(jié)果表明,與陰性對照組相比,DON暴露24 h后能明顯的破壞染色體結(jié)構(gòu),使染色體缺失或畸形的數(shù)量明顯上升(62±13.01/30 cells,0 ng/mL DON vs 206.17±18.40/30 cells,50 ng/mL DON,24 h,P0.01)。 結(jié)論： (1)DON的暴露能明顯抑制人淋巴細(xì)胞的細(xì)胞活力。提示DON具有潛在的細(xì)胞毒性。 (2)人淋巴細(xì)胞暴露于DON環(huán)境中,細(xì)胞的DNA損傷程度、微核數(shù)量以及染色體損傷數(shù)量明顯增加。提示DON具有潛在的遺傳毒性特征。 第二部分 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇導(dǎo)致人外周血淋巴細(xì)胞氧化應(yīng)激的機(jī)制研究 目的：以人外周血淋巴細(xì)胞為研究對象,探討DON造成的氧化應(yīng)激與DNA損傷和染色體損傷之間的關(guān)系。 方法： (1)人群血樣采集與細(xì)胞提取過程和培養(yǎng)方法參照第一部分。 (2)利用高效液相色譜法對DON導(dǎo)致人外周血淋巴細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物進(jìn)行定性及定量分析。 (3)利用高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用法對GSH含量及GSSG的含量進(jìn)行定量和定性分析。 (4)利用熒光探針法(DCFH-DA)裝載細(xì)胞培養(yǎng)基,對細(xì)胞中ROS的含量進(jìn)行定量分析,并利用激光共聚焦顯微鏡對細(xì)胞內(nèi)ROS進(jìn)行熒光定性分析。 (5)利用Annexin V-FITC探針法裝載細(xì)胞后,在流式細(xì)胞儀中對膜損傷情況進(jìn)行定量分析。 (6)利用ELISA法檢測DNA氧化性損傷標(biāo)志物(8-OHdG)在人淋巴細(xì)胞中的含量,對DNA損傷進(jìn)行初步的評估。 結(jié)果： (1)人外周血淋巴細(xì)胞染毒DON后(24 h),與陰性對照組相比,DON組的MDA的含量明顯上升(19.64 nmol/mL,0 ng/mL DON vs 110.44±10.81 nmol/mL,50 ng/mL DON,24 h, P0.01)。 (2)人外周血淋巴細(xì)胞染毒DON后(24 h),與陰性對照組相比,DON組中GSH的含量明顯下降(104.84±7.46 nmol/mg protein,0 ng/mL DON vs 32.66±2.02 nmol/mg protein,50 ng/mL DON,24 h, P0.01), GSSG的含量隨之升高(53.1±5.06 nmol/mg protein,50 ng/mL DON vs 2.98±0.20 nmol/mg protein,0 ng/mL DON,24 h, P0.01)。 (3)人外周血淋巴細(xì)胞染毒DON后(24 h),與陰性對照組相比,ROS熒光探針的熒光強(qiáng)度隨時間-劑量而增強(qiáng)(3.68±0.18%,0 ng/mL DON vs 69.83±4.26%,50 ng/mL DON,24 h, P 0.01)。并且在激光共聚焦顯微鏡成像圖中,可以觀察到細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增強(qiáng),細(xì)胞形態(tài)由正常形態(tài)逐漸變的固縮及變形,細(xì)胞膜逐漸失去光澤并呈現(xiàn)出不規(guī)則表面。 (4)在DON暴露24 h后,FITC探針與細(xì)胞膜磷脂結(jié)構(gòu)的結(jié)合強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(6.35±0.44%,0 ng/mL DON vs 81.63±7.96% 50 ng/mL DON,24 h, P0.01)。 (5)DON暴露24 h后,染毒組8-OHdG的含量明顯高于陰性對照組(27.30±2.18pg/mL,0 ng/mL DON vs 410.35±12.88 pg/mL,50 ng/mL DON,24 h, P0.01)。 結(jié)論： (1)DON能造成氧自由基的增多削弱抗氧化酶的活力,致使細(xì)胞內(nèi)(膜)的過氧化加劇。 (2)細(xì)胞壞死的數(shù)量和細(xì)胞膜變形,可能與DON造成的氧自由基增高有關(guān)。 (3)由于DON使8-OHdG的含量明顯上升,提示DON導(dǎo)致人淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性和遺傳毒性與DON導(dǎo)致DNA氧化性損傷有關(guān)。 第三部分 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對人外周血淋巴細(xì)胞遺傳毒性的分子毒理學(xué)機(jī)制 目的：以人淋巴細(xì)胞染毒DON為體外模型,利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步探討DON對人淋巴細(xì)胞遺傳毒性的分子毒理學(xué)機(jī)制。 方法： (1)人群血樣采樣和細(xì)胞培養(yǎng)方法均與第一部分相同。 (2)利用RT-PCR法,測定人淋巴細(xì)胞在染毒DON 6、12和24 h后的DNA修復(fù)相關(guān)基因(PARP-1、PARP-2、RAD51、APE-1、ERCC-1、TP-53、hOGG-1、PCNA、XRCC-1、XRCC-3、XRCC-4和HO-1)的mRNA的表達(dá)水平。 (3)利用Western-Blot法檢測堿基切除修復(fù)關(guān)鍵基因hOGG1和XRCC1的蛋白表達(dá)水平。 (4)利用Western-Blot法檢測HO-1的蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果： (1) RT-PCR的結(jié)果顯示,DNA修復(fù)相關(guān)基因和HO-1均在6h時表達(dá)明顯高于陰性對照組(P0.01),并在染毒12h時,出現(xiàn)下降的趨勢(P0.05)。在24 h時,與陰性對照組無顯著性差異(P0.05)。 (2) Western-Blot的結(jié)果提示,與陰性對照組相比,堿基切除修復(fù)機(jī)制中的關(guān)鍵基因hOGG-1和XRCC1的蛋白表達(dá)水平在短時間內(nèi)明顯升高(P0.01)。而在12 h時,hOGG-1的蛋白表達(dá)水平逐漸下降(P0.05),XRCC-1卻沒有顯著性差異(P0.05)。在24h時，，M3GG-1和XRCC1的蛋白表達(dá)水平均與陰性對照組無明顯差異(P0.05)。(3) Westenr-Blot的結(jié)果表明，染毒6、12和24h后，與陰性對照組相比，HO-1的蛋白表達(dá)水平在6 h時明顯升高（P0.05)。但在染毒12和24小時后，沒有顯著性差異（P0.05)。結(jié)論-(1) 結(jié)果提示，DON能夠在短時間內(nèi)刺激DNA修復(fù)能力的提升，但DON濃度的增加和染毒時間的延長會抑制DNA修復(fù)能力。(2) Western-Blot的結(jié)果表明M)GG-1、HO-1和XRCC-1在6 h時，有表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象。而在12和24 h時，與陰性對照組相比較無明顯差異。HO-1的表達(dá)抑制可能與DNA修復(fù)能力下降有關(guān)。
[Abstract]:Mycotoxin (MYO) is a toxic and harmful two grade metabolite produced by fungi or fungi. In soil, plants, grains, forage, and silage can be found to be mycotoxins. Mycotoxins can be formed when crops are harvested. In unsuitable storage conditions, mycotoxins can also continue to form crops after harvest. About 25% grains in the world are polluted by various moulds every year. Because of the different degree of pollution, the gap between different regions is very large, and China is one of the major disaster areas of mycotoxin pollution.
Deoxynivalenol (DON), also known as vomit toxin (Vomitoxin), can cause great harm to human health. It is mainly a toxic metabolite of the chemical structure and biological activity similar to the biological activity of certain strains of Fusarium - one of the main producing strains of.DON in the monospore compound is the grasses. Fusarium Graminearum, it is reported that some other Fusarium bacteria may also produce.DON as a highly toxic group. Previous studies have shown that DON may have a certain accumulation in the body and have strong cytotoxicity, but there is no special target organ. After eating food / feed from DON, people and animals can cause anorexia, vomiting and diarrhea. Symptoms of acute poisoning such as fever, unsteadiness of standing and slow reaction can seriously damage the hematopoietic system and cause death.
At present, in food safety and basic toxicology research (teratogenicity) also found that DON can be detected in a lot of food with very low content. For example, the DON content of 1 ppm can be detected in wheat products, the DON content of 10ppm can be detected in 4 month old chicken, the DON content of 5ppm can be detected in pork and the presence of DON in all kinds of wine can be detected. The study points out that 100 ng/mL DON can cause the decline of cell division index, overexpression of inflammatory substances and apoptosis of cells. Low dose DON can cause micronucleus and chromosome aberration in V79 cells; oral administration (1000 mg/kg) can cause bone malformation of fetal and broilers and decrease the number of germ cells in mice and the decrease in the number of germ cells in mice. In summary, different doses of DON can cause different degrees of damage to animal organs and cells, especially the decline in the number and vitality of the germ cells, which also suggests that DON may have potential cytotoxicity and genotoxicity. However, to date, the literature about whether DON has a relic on human primary cells The molecular toxicology of transmission toxicity and toxicity is relatively small.
Therefore, the purpose of this study is to observe the cytotoxicity and genotoxicity of DON on human primary cells by using human peripheral blood lymphocytes as experimental subjects, and to study the molecular level of cytotoxicity and genotoxicity by molecular biology techniques.
Part one
Genotoxicity of deoxynivalenol in human peripheral blood lymphocytes
Objective: To observe the inhibitory effect of DON on the cell viability of human lymphocytes (IC50), the damage to DNA of human lymphocytes and the effect on the chromosome damage of human lymphocytes.
Method錛

本文編號：1915230