本文選題：環(huán)境雌激素 + 雙酚A�。� 參考：《福建醫(yī)科大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：雙酚A（Bisphenol A，BPA）學(xué)名2，2-二（4-羥基苯基）丙烷，是世界已知重要的環(huán)境雌激素之一。BPA是人工合成的高分子材料的單體，是生產(chǎn)塑料增塑劑、農(nóng)藥、涂料等化工產(chǎn)品的原料。在嬰兒奶瓶、飯盒、玩具及自來水管等材料中廣泛存在。雙酚A單體可從盛裝食物或飲料的塑料容器中游離出來，在高溫或強(qiáng)酸堿等條件下可加速游離過程。BPA暴露人群非常廣泛，流行病學(xué)研究表明，超過90%的個體尿中可檢測到BPA。BPA的化學(xué)結(jié)構(gòu)與乙烯雌酚類似，進(jìn)入體內(nèi)可模擬雌激素活性。 目前歐盟、美國和中國等眾多國家只是禁止含BPA的塑料用于制造嬰兒奶瓶，實(shí)際上，青春期前的兒童BPA暴露也是一個值得關(guān)注的問題。這個時(shí)期是生殖系統(tǒng)發(fā)育成熟前的一個關(guān)鍵階段。這個時(shí)期的兒童可能通過多種途徑暴露于BPA，特別是發(fā)生食品和飲水污染事件時(shí)，兒童還可能會短期暴露于較高濃度的BPA。盡管環(huán)境雌激素與天然激素相比在體內(nèi)的濃度較低，但由于處于發(fā)育期的兒童下丘腦－垂體－性腺軸尚未發(fā)育成熟，體內(nèi)性激素水平比較低，此時(shí)的個體對外源性雌激素的反應(yīng)較成年敏感。同時(shí)，較高濃度的BPA對卵巢發(fā)育的毒性效應(yīng)問題也不容忽視。我們推測，青春期前較高濃度BPA短期暴露很可能會影響雌性卵泡的正常發(fā)育過程，并且有可能通過影響卵泡發(fā)育相關(guān)調(diào)控基因而發(fā)揮作用。本研究通過觀察促進(jìn)卵泡發(fā)育的Kitlg、Figla和H1foo基因以及抑制卵泡發(fā)育的AMH基因表達(dá)的表達(dá)和DNA甲基化模式，探討卵巢發(fā)育相關(guān)的基因在大鼠BPA短期暴露所致卵巢發(fā)育毒性中的作用及其分子生物學(xué)機(jī)制，為進(jìn)一步闡明BPA對兒童生殖系統(tǒng)發(fā)育的影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分：青春期前BPA暴露對卵巢發(fā)育和功能的影響 目的：通過建立青春期前BPA短期暴露的大鼠動物模型，觀察BPA對卵巢形態(tài)、功能，卵泡細(xì)胞的凋亡以及卵巢細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)等改變，探討青春期前BPA暴露對卵巢發(fā)育和功能的影響。 方法：28日齡雌性wistar大鼠通過腹腔注射BPA（10mg/kg、40mg/kg、160mg/kg），每天染毒1次，連續(xù)染毒1周。觀察卵巢重量、各級卵泡構(gòu)成、卵泡凋亡（TUNEL）、陰道開放率、第一次動情期出現(xiàn)率、血清性激素水平、卵巢細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果： 1.青春期前大鼠BPA暴露后，染毒組大鼠在各個時(shí)間段的體重與對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；BPA染毒組的卵巢重量和臟器系數(shù)隨染毒劑量升高而出現(xiàn)下降，其中40mg/kg和160mg/kgBPA組大鼠卵巢重量與對照組比較有顯著性差異（P＜0.01）。 2.各染毒劑量組陰道開放率和和首次動情期出現(xiàn)率對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 3.隨染毒劑量增加，各染毒組大鼠血清雌E2水平有下降趨勢，與對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）。而血清P4水平與對照組比較有顯著性差異（P＜0.01），其中，40mg/kg和160mg/kg BPA組血清P4水平下降與對照組比較有顯著性差異（P＜0.01）。 4.隨著染毒劑量升高，各染毒組卵泡數(shù)量呈下降趨勢，其中10mg/kg、40mg/kg和160mg/kg BPA組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01和P＜0.01）；始基卵泡、初級卵泡/腔前卵泡、有腔卵泡和黃體構(gòu)成比均呈下降趨勢，而閉鎖卵泡構(gòu)成比有升高趨勢，其中40mg/kg和160mg/kg BPA組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 5.隨染毒劑量的增加，各染毒劑量組中，腔前卵泡、有腔卵泡以及黃體/白體凋亡率均呈現(xiàn)上升趨勢，與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 6.電鏡觀察卵巢細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，與對照組比較，40mg/kg BPA組和160mg/kgBPA組鏡下的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)顯示，細(xì)胞內(nèi)脂肪變性增多，，次級溶酶體增多，尤其在160mg/kg BPA組中，大部分細(xì)胞胞質(zhì)中幾乎都充斥著脂肪顆粒和次級溶酶體。 第二部分：青春期前BPA暴露對卵泡發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響 目的：青春期前BPA暴露影響卵泡發(fā)育過程中，對發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響，探討B(tài)PA卵巢毒性的分子機(jī)制。 方法：整體動物模型同前，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot分析以及免疫組化技術(shù)檢測卵泡發(fā)育相關(guān)基因：干細(xì)胞因子（KITLG）、基礎(chǔ)螺旋環(huán)轉(zhuǎn)錄因子（FIGLA）、卵母細(xì)胞特有的H1連結(jié)組蛋白(H1FOO)、抗苗勒激素（AMH）的mRNA及其蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果： 1.各染毒劑量組Kitlg mRNA相對表達(dá)量呈下降趨勢，其中160mg/kgBPA組與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p㩳0.01)；各染毒劑量組Figla mRNA相對表達(dá)量呈下降趨勢，其中160mg/kgBPA組與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p㩳0.05)；各染毒劑量組H1foo mRNA相對表達(dá)量呈下降趨勢，與對照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p㩳0.01)；各染毒劑量組AMH mRNA相對表達(dá)量呈上升趨勢，其中40mg/kgBPA組和160mg/kgBPA組與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p㩳0.05和p㩳0.01)。 2. Western blot結(jié)果顯示，KITLG蛋白表達(dá)水平在各BPA染毒組均呈明顯下調(diào)，其中10mg/kg BPA組和40mg/kg BPA組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），160mg/kg BPA組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；FIGLA蛋白表達(dá)水平在160mg/kg BPA組呈明顯下調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；H1FOO蛋白表達(dá)水平在各BPA染毒組均呈明顯下調(diào)，其中10mg/kgBPA組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），40mg/kg和160mg/kg BPA組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；AMH蛋白表達(dá)水平在各BPA染毒組均呈明顯上調(diào)，其中10mg/kg BPA組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），40mg/kg和160mg/kg BPA組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 第三部分青春期前BPA暴露影響卵泡發(fā)育的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制研究 目的：從卵巢細(xì)胞DNA總甲基化狀態(tài)和卵泡發(fā)育相關(guān)基因啟動子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)兩個方面，初步探討B(tài)PA的表觀遺傳學(xué)的調(diào)控機(jī)制。 方法：整體動物模型同前，卵巢細(xì)胞DNA總甲基化采用免疫組化檢測卵巢細(xì)胞5-甲基胞嘧啶（5-mC）水平。采用亞硫酸氫鹽修飾后測序法（BSP）檢測卵巢發(fā)育相關(guān)基因Kitlg啟動子區(qū)CpG島的甲基化狀況。 結(jié)果： 1.隨著染毒劑量的增加，卵巢顆粒細(xì)胞5-mC免疫組化的平均光密度值（OD）和積分光密度值（IOD）呈總體上升趨勢，其中，40mg/kg BPA組和160mg/kg BPA組與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 2.采用Methprimer軟件對以上全部基因的啟動子區(qū)域進(jìn)行CpG島檢測，只有Kitlg基因啟動子區(qū)存在一個CpG島，35個甲基化位點(diǎn)。Kitlg基因BSP產(chǎn)物重組T載體質(zhì)粒的測序結(jié)果顯示，隨著染毒劑量增加，發(fā)生Cs的個數(shù)呈上升趨勢，其中，160mg/kg BPA組Cs的甲基化率與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；第7甲基化位點(diǎn)（Cs）在對照組存在甲基化狀態(tài)，在染毒組中出現(xiàn)較為明顯的去甲基化現(xiàn)象；第16甲基化位點(diǎn)在對照組呈現(xiàn)無甲基化狀態(tài)，而隨著染毒劑量增加，在染毒組中出現(xiàn)較為明顯的甲基化現(xiàn)象。 結(jié)論： 根據(jù)以上結(jié)果結(jié)合討論可得出如下結(jié)論: 1.青春期前BPA較高濃度短期暴露可能對卵巢卵泡的發(fā)育和性激素分泌功能具有抑制毒效應(yīng)，主要表現(xiàn)為卵巢重量及卵巢臟器系數(shù)下降、卵泡總數(shù)下降、生長卵泡構(gòu)成比下降及閉鎖卵泡構(gòu)成比升高、卵泡凋亡率升高、血清孕激素水平下降。 2.促進(jìn)卵泡發(fā)育的Kitlg基因、Figla基因、H1foo基因表達(dá)水平下調(diào)以及抑制卵泡發(fā)育的AMH基因表達(dá)上調(diào)，可能在青春期前BPA暴露抑制卵巢發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用。 3. DNA甲基化模式的改變在Kitlg、Figla、H1foo及AMH等基因表達(dá)調(diào)控中的可能作用值得我們重視；Kitlg基因表達(dá)下調(diào)可能與其啟動子區(qū)CpG島甲基化模式的改變有關(guān)。
[Abstract]:Bisphenol A (Bisphenol A, BPA) 2,2- two (4- hydroxy phenyl) propane, which is one of the important environmental estrogens known in the world,.BPA is a synthetic polymeric material. It is a raw material for the production of plastic plasticizers, pesticides, coatings and other chemical products. It is widely used in baby bottles, rice boxes, toys and water pipes. Bisphenol A monomer. It can be dissociated from plastic containers filled with food or drink, which can accelerate the free process of.BPA exposure under high temperature or strong acid and alkali conditions. Epidemiological studies have shown that more than 90% of individual urine can detect the chemical structure of BPA.BPA, similar to vinyl estrin, and can mimic estrogen activity in the body.
At present, many countries such as the EU, the United States and China have banned BPA - based plastic for baby bottles. In fact, BPA exposure in pre puberty children is also a matter of concern. This period is a critical stage before the maturation of the reproductive system. Children in this period may be exposed to BPA in a variety of ways, especially in a variety of ways. In the event of food and drinking water pollution, children may also be exposed to a relatively high concentration of BPA. in the short term, although the concentration of environmental estrogens in the body is low compared with natural hormones, but the hypothalamo pituitary gonadal axis of the children in development is not mature and the level of sex hormone is low in the body, and the individual external origin is at this time. Estrogen response is more sensitive to adulthood. At the same time, the toxic effects of higher concentrations of BPA on ovarian development can not be ignored. We speculate that short exposure to high concentrations of BPA before puberty may affect the normal development of female follicles and may play a role in the regulation of ovarian follicle development related genes. By observing the expression of Kitlg, Figla and H1foo genes and the expression of AMH gene expression in follicle development and the DNA methylation pattern, the role of ovarian development related genes in ovarian development toxicity induced by BPA short term exposure in rats and its molecular biological mechanism are discussed in order to further clarify the reproductive system of BPA in children. The effect of breeding provides experimental basis.
Part one: effects of pre pubertal BPA exposure on ovarian development and function
Objective: To observe the changes of ovarian morphology, function, follicular cell apoptosis and ovarian cell ultrastructure, and to explore the effect of pre puberty BPA exposure on ovarian development and function by establishing a rat model of prepuberty BPA short term exposure.
Methods: 28 day old female Wistar rats were injected with BPA (10mg/kg, 40mg/kg, 160mg/kg) and were poisoned for 1 times a day for 1 weeks. The ovarian weight, follicle formation at all levels, follicle apoptosis (TUNEL), the opening rate of vagina, the rate of first estrus, the level of serum sex hormone and the ultrastructure of ovarian cells were observed.
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本文編號：1855737