本文選題：重組葡萄球菌腸毒素 + 細(xì)胞因子��； 參考：《天津大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：葡萄球菌腸毒素(Staphyloccucal enterotoxins,SEs)主要是由葡萄球菌產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)相關(guān)、毒力相似的可溶性胞外毒蛋白,可引發(fā)急性腸胃炎及其它免疫性疾病。已發(fā)現(xiàn)的腸毒素及腸毒素樣基因型共20余種,但有關(guān)新型腸毒素的研究主要停留于基因型檢測水平。本課題主要研究了幾種新型重組腸毒素的毒性和超抗原活性,并初步探討了蛋白分子結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系。 應(yīng)用構(gòu)建的pET28α-ses重組載體經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、鎳鰲合層析純化,獲得高純度且具有活性的重組蛋白SEA-HIS、SEO-HIS、SEG-HIS、SEK-HIS、SEU-HIS、和SEQ-HIS。將4周齡小鼠平均分成15組,每組7只,尾靜脈注射20μg/g和5μg/kg的六種重組蛋白和天然SEA,以PBS做空白對照,72h后取胸腺、脾臟和肝臟。計(jì)算臟器指數(shù)并檢測肝臟外源化合物代謝酶活性及IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ幾種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)水平。應(yīng)用于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評價(jià)腸毒素對T細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的影響。利用origin 7.5獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)法分析腸毒素處理組與PBS對照組差異的顯著性。 在20μg/g至毒劑量下,SEA-HIS、SEQ-HIS能下調(diào)體內(nèi)Th1類細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ)和Th2類細(xì)胞因子(IL-4、IL-6)的轉(zhuǎn)錄水平,SEK-HIS、SEG-HIS和SEO-HIS能上調(diào)炎性因子IFN-γ。A、O、G、K、Q型腸毒素均能影響肝臟POD、SOD、GSH-PX、LDH的活性,上調(diào)TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平,在50μg/mL劑量下誘導(dǎo)體外T淋巴細(xì)胞凋亡。 在4μg/mL劑量下,四種新型重組腸毒素(K、Q、G、O型)與經(jīng)典天然SEA相似,刺激體外T淋巴細(xì)胞增殖,具有超抗原活性,且超抗原活性強(qiáng)弱與T細(xì)胞TCR的Vβ亞型和MHCII分子有關(guān)。按促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖能力的強(qiáng)弱排序,腸毒素的超抗原活性由強(qiáng)至弱的順序?yàn)?K、Q、A、G、O,U型腸毒素不表現(xiàn)超抗原活性,這與根據(jù)蛋白分子α3-β8環(huán)及Zn離子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合能力所預(yù)測的超抗原活性強(qiáng)弱順序一致。在5μg/kg體內(nèi)劑量和4μg/mL的體外劑量下, A、O、G、K、Q型腸毒素均能促進(jìn)IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。 綜上所述,重組葡萄球菌腸毒素可引起機(jī)體肝臟外源化合物代謝酶的變化,誘發(fā)炎癥反應(yīng),具有一定的肝臟毒性; A、O、G、K、Q型腸毒素具有差異化影響機(jī)體細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄,淋巴細(xì)胞分化的能力,表現(xiàn)出不同的超抗原活性。新型葡萄球菌腸毒素毒性及其超抗原活性提出食品安全新問題。
[Abstract]:Staphylocucal enterotoxin (SES) is a kind of soluble extracellular toxin produced by Staphylococcus, which has similar virulence and can cause acute gastroenteritis and other immune diseases. There were more than 20 enterotoxin and enterotoxin like genotypes, but the study of new enterotoxins was mainly at the level of genotypic detection. The toxicity and superantigen activity of several new recombinant enterotoxins were studied, and the relationship between molecular structure and function of proteins was discussed. The recombinant protein SEA-HIS-SEO-HIS-SEG-HIS-SEK-HIS-SEU-HISS, and SEQ-HISs were obtained by using the recombinant pET28 偽 -ses recombinant vector, which was induced and purified by nickel chelation chromatography. The recombinant proteins SEA-HIS-SEO-HIS-SEG-HIS-SEK-HIS-HIS-SEU-HISS and SEQ-HISwere obtained. Four week-old mice were divided into 15 groups with 7 mice in each group. Six recombinant proteins (20 渭 g / g and 5 渭 g/kg) and natural sea were injected into caudal vein. Thymus, spleen and liver were taken after 72 hours of control with PBS. The organ index was calculated and the activity of exogenous metabolizing enzymes in liver and the transcription and expression level of IL-6 TNF- 偽 -IFN- 緯 cytokines were measured. The effects of enterotoxin on T cell proliferation, apoptosis and cytokine transcription and expression were further evaluated in vitro. The significance of the difference between enterotoxin treatment group and PBS control group was analyzed by origin 7.5 independent sample T test. At doses of 20 渭 g / g to 20 渭 g / g, SEA-HIS-SEQ-HIS could down-regulate the transcription levels of Th1 cytokines (IL-2tIFN- 緯) and Th2 cytokines (IL-4). SEK-HISG-HIS and SEO-HIS could up-regulate the activity of inflammatory factor IFN- 緯. AOGKKQ enterotoxin, and up-regulate the transcriptional level of TNF- 偽. In vitro T lymphocyte apoptosis was induced at the dose of 50 渭 g/mL. At the dose of 4 渭 g/mL, the four new recombinant enterotoxins, named KGN, are similar to the classical natural SEA, and stimulate the proliferation of T lymphocytes in vitro. The superantigen activity is related to the V 尾 subtype of T cell TCR and the MHCII molecule. According to the order of promoting T lymphocyte proliferation, the order of superantigen activity of enterotoxin from strong to weak was that the superantigen activity of Enterotoxin was not superantigen. This is consistent with the order of superantigen activity predicted by the binding ability of 偽 3- 尾 8 and Zn binding sites of protein molecules. Both in vivo and in vitro doses of 5 渭 g/kg and 4 渭 g/mL could promote the transcription and expression of TNF- 偽 -IFN- 緯. In conclusion, recombinant staphylococcal enterotoxin can induce the changes of exogenous metabolizing enzymes in the liver, induce inflammatory reaction, and have certain liver toxicity. The ability of lymphocyte differentiation showed different superantigen activity. The toxicity of new staphylococcal enterotoxin and its superantigen activity raise new food safety problems.
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R114

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本文編號：1802434