本文選題：RAD54 + 酵母細(xì)胞　； 參考：《揚(yáng)州大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：隨著工農(nóng)業(yè)社會的發(fā)展,各種化學(xué)物通過各種途徑排入環(huán)境中,通過大氣循環(huán)、水循環(huán)和食物鏈等方式進(jìn)入人體。但是,當(dāng)前關(guān)于致突變的安全性評價的相關(guān)研究課題大多是聚焦于對單一化合物的評價,如何評價兩種或兩種以上化學(xué)物致突變效果,目前研究少。不可回避的問題是在自然環(huán)境中是多種污染物共存的,各化學(xué)物在生物體內(nèi)彼此影響,作用方式復(fù)雜,產(chǎn)生多種聯(lián)合作用效應(yīng)。本研究通過建立一種雙信號重組酵母細(xì)胞模型,借助響應(yīng)面分析法對有關(guān)實驗參數(shù)進(jìn)行回歸擬合,結(jié)合響應(yīng)面曲線和等高線的描述分析,可直觀的得出各化學(xué)誘變原的交互作用結(jié)果。1.RAD54啟動子的選擇將2種不同長度RAD54啟動子調(diào)控的yEGFP報告載體(pR1 558-yEGFP,pR406-yEGFP)分別轉(zhuǎn)入W303-1A酵母細(xì)胞中,構(gòu)建成2種啟動子調(diào)控的發(fā)光酵母細(xì)胞,分別命名為W303-1A/R1558-yEGFP和W303-1A/R406-yEGFP。用不同化學(xué)誘變原作用后,用流式細(xì)胞儀和多功能發(fā)光儀測酵母的發(fā)光強(qiáng)度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種啟動子調(diào)控的酵母細(xì)胞發(fā)光強(qiáng)度均與化學(xué)誘變原(甲磺酸甲脂、4-硝基-N氧化喹啉和5-氟尿嘧啶)有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系,但是W303-1A/R1558-yEGFP劑量效應(yīng)關(guān)系較為明顯,產(chǎn)生的最大誘導(dǎo)倍數(shù)(5.96、2.19和2.71)明顯高于W303-1A/R406-yEGFP所產(chǎn)生的最大誘導(dǎo)倍數(shù)(2.53、1.79和1.91),同時發(fā)現(xiàn)流式細(xì)胞儀測定效果明顯優(yōu)于發(fā)光儀。所以用RAD54全啟動子調(diào)控重組發(fā)光酵母細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合基因毒性研究。2.RAD54全啟動區(qū)調(diào)控的雙信號發(fā)光酵母細(xì)胞的構(gòu)建由于細(xì)胞的發(fā)光除與誘變原的誘導(dǎo)有關(guān)外,還受細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞“狀態(tài)”的影響,利用DsRed-Express2(紅色熒光蛋白)作為第二信號,建立R1558啟動子調(diào)控的紅、綠熒光蛋白基因發(fā)光酵母細(xì)胞。當(dāng)化學(xué)誘變原作用于該重組酵母細(xì)胞時,yEGFP/DsRed-Express2(相對發(fā)光度)與化學(xué)誘變原間具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。3.響應(yīng)面聯(lián)合致突變分析方法的建立(1)首先對化學(xué)誘變原進(jìn)行單因素基因毒性研究首先用化學(xué)誘變原對重組基因雙信號發(fā)光酵母細(xì)胞進(jìn)行單因素實驗研究,用多功能發(fā)光分析儀分別測yEGFP和DsRed-Express2的發(fā)光強(qiáng)度,求其相對發(fā)光度。參照Ames實驗判斷的標(biāo)準(zhǔn),即受試物作用于重組細(xì)胞后產(chǎn)生的相對發(fā)光度為對照1.5倍以上,并具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系,則判斷為陽性。根據(jù)劑量效應(yīng)關(guān)系確定各化學(xué)誘變原作用閾濃度。(2)選用MMS、瘤可寧和順鉑進(jìn)行聯(lián)合基因毒性研究發(fā)現(xiàn),三者交互作用參數(shù)(β123,P=0.011)有統(tǒng)計學(xué)意義,說明化學(xué)物間存在交互作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)MMS與瘤可寧(β12,P=0.113)、瘤可寧和順鉑(β23,P=0.613)無統(tǒng)計學(xué)意義,而MMS和順鉑(β13,P0.005)交互作用明顯。再通過響應(yīng)面等高線圖分析可以看出MMS和順鉑之間不呈線性關(guān)系,隨著濃度的升高曲線先呈弓弧線向內(nèi),再呈現(xiàn)弓弧線向外的趨勢,說明兩者之間在低濃度時有拮抗作用,高濃度時表現(xiàn)出協(xié)同作用。(3)選用5-氟尿嘧啶、喜樹堿和羥基脲進(jìn)行聯(lián)合基因毒性研究發(fā)現(xiàn),三者交互作用參數(shù)(β123,P0.001)有統(tǒng)計學(xué)意義,說明三者之間存在交互作用。經(jīng)過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)5-氟尿嘧啶與喜樹堿(β12,P=0.008)、5-氟尿嘧啶與羥基脲(β13,P=0.006)、喜樹堿與羥基脲(β23,P=0.006),兩兩間存在不同程度的交互作用。從響應(yīng)面曲線等高線圖中可以看出喜樹堿和5-Fu之間不呈線性關(guān)系,隨著濃度的升高曲線呈現(xiàn)弓弧線向外的趨勢,可見兩者之間表現(xiàn)出協(xié)同作用。
[Abstract]:A double - signal recombinant yeast cell model was established to study the effects of two or more kinds of chemical mutagens . The results showed that the fluorescence intensity of the two promoters was significantly higher than that of W303 - 1A / R1558 - yEGFP . The results showed that 5 - fluorouracil and camptothecin ( 尾12 , P = 0.008 ) , 5 - fluorouracil and hydroxyurea ( 尾13 , P = 0.006 ) , camptothecin and hydroxyurea ( 尾23 , P = 0.006 ) showed no linear relationship .

【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1798541