本文選題：小清蛋白 + 間接ELISA��； 參考：《上海師范大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：魚(yú)類及其制品含有豐富的營(yíng)養(yǎng),同時(shí)也是FAO及WHO認(rèn)定的導(dǎo)致人類過(guò)敏的八大類食物之一。其中魚(yú)肉中的小清蛋白(parvalbumin,PV)被視為主要的過(guò)敏原,因此開(kāi)展針對(duì)魚(yú)類及其制品中小清蛋白強(qiáng)特異性、高靈敏度的檢測(cè)具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。本文研究主要包括小清蛋白單克隆抗體的制備及鑒定、金磁復(fù)合納米微粒與酶標(biāo)抗原的制備以及小清蛋白金磁酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的建立。具體研究?jī)?nèi)容如下:魚(yú)類主要過(guò)敏原小清蛋白的制備使用硫酸銨分級(jí)沉淀法,從新鮮的鯽魚(yú)魚(yú)肉中提取、純化過(guò)敏原小清蛋白,經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳表征過(guò)敏原小清蛋白的純度,最后凍干樣品后保存于-20℃冰箱備用。2、小清蛋白單克隆抗體的制備以高純度的PV免疫4只BALB/c小鼠,利用間接ELISA方法測(cè)小鼠抗血清效價(jià),獲取效價(jià)最高的小鼠(PV效價(jià)為1:256000)。取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合,獲得雜交瘤細(xì)胞。間接ELISA方法篩選陽(yáng)性孔,有限稀釋法進(jìn)行3次亞克隆得到分泌同質(zhì)的雜交瘤細(xì)胞株。采用小鼠體內(nèi)誘生腹水法大量制備單抗。3、小清蛋白單克隆抗體的鑒定采用辛酸-硫酸銨沉淀法純化單抗腹水,SDS-PAGE凝膠電泳表征單克隆抗體純度,并采用Western-blotting、考馬斯亮藍(lán)染色法分別檢測(cè)單抗特異性及抗體濃度,結(jié)果顯示PV單克隆抗體具備良好的特異性,并且單抗?jié)舛葹?00ug/mL,最后通過(guò)商業(yè)化試劑盒檢測(cè)PV單抗亞類為IgG1型。4、金磁(Fe_3O_4/Au)復(fù)合微粒與酶標(biāo)抗原的制備采用一鍋法制備氨基化的磁性微粒Fe_3O_4-PEI,之后在其表面包覆兩層Au顆粒,制備金磁(Fe_3O_4/Au)復(fù)合微粒,金磁復(fù)合微粒形貌呈圓形,粒徑均一,粒徑約150nm。采用過(guò)碘酸鈉法制備辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記PV,用于后面金磁酶聯(lián)免疫體系的建立。5、金磁酶聯(lián)免疫法檢測(cè)過(guò)敏原小清蛋白體系的建立按照最佳條件制備得到金磁免疫探針和PV酶標(biāo)抗原后,將它們與PV標(biāo)準(zhǔn)溶液競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合建立金磁酶聯(lián)免疫檢測(cè)體系,初步探究了該體系在魚(yú)類及其制品中檢測(cè)小清蛋白的可行性。研究結(jié)果顯示PV濃度5.5-289ng/ml范圍內(nèi),PV濃度對(duì)數(shù)與抑制率有良好的線性關(guān)系,標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=34.96x-6.0357,R~2=0.9979;IC_(50)為40.1ng/mL,LOD為2.8ng/mL。此外,對(duì)該檢測(cè)體系進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià),包括精密度、特異性、穩(wěn)定性。結(jié)果顯示該方法對(duì)PV檢測(cè)的批內(nèi)變異系數(shù)在4.3%-9.6%之間,批間變異系數(shù)在5.5%-11.7%之間;該方法與食品中其他主要過(guò)敏原蛋白交叉反應(yīng)率都小于1%,具有良好的特異性,并且金磁探針的穩(wěn)定性在15天左右。此金磁酶聯(lián)免疫法可以提高檢測(cè)的靈敏度和特異性,在食品安全檢測(cè)中有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
[Abstract]:Fish and its products are rich in nutrition and one of the eight kinds of food identified by FAO and WHO as causing human allergies.The protein parvalbumin (PVV) in fish is regarded as the main allergen, so it is of great theoretical and practical significance to develop a highly specific and sensitive detection method for small and medium albumin in fish and its products.In this paper, the preparation and identification of monoclonal antibody against white white protein, the preparation of gold magnetic composite nanoparticles and enzyme labeled antigen, and the establishment of gold magnetic enzyme linked immunosorbent assay for white white protein were studied.The main contents of the study were as follows: the preparation of the main allergen microalbumen in fish was extracted from fresh crucian carp meat by ammonium sulfate precipitation method and purified. The purity of the protein was characterized by SDS-PAGE gel electrophoresis.Finally, freeze-dried samples were stored in -20 鈩，

本文編號(hào)：1770945