本文選題：神經(jīng)干細胞　切入點：神經(jīng)發(fā)生　出處：《第三軍醫(yī)大學》2012年博士論文

【摘要】：目的：甲狀腺是多種職業(yè)有害因素損傷的主要靶器官之一。研究表明，妊娠期多種類型職業(yè)有害因素暴露均可導致機體甲狀腺激素(TH)缺乏，從而損傷子代神經(jīng)發(fā)育。TH是調(diào)控腦發(fā)育的必要激素之一，發(fā)育期間TH缺乏可導致突出生長、突觸形成、神經(jīng)元遷移、髓鞘形成等多種發(fā)育障礙。盡管既往針對TH對腦發(fā)育的影響研究較多，但大都集中在對TH在妊娠晚期及出生后功能的探討，而TH在胚胎早期發(fā)育過程中的作用，尤其是對胚胎神經(jīng)干細胞(neural stem cells, NSCs)的作用及機制未見文獻報道。文獻報道表明，TH在妊娠早期既已出現(xiàn)在胚胎腦內(nèi)，且甲狀腺激素受體(TR)在胚胎腦內(nèi)出現(xiàn)的時間比TH還早，提示TH-TR極有可能參與調(diào)控了早期腦的發(fā)育過程�；谝陨险J識，本研究擬通過建立妊娠期甲減動物模型，探討妊娠期TH缺乏對胚胎腦神經(jīng)發(fā)生的影響及子代鼠成年后學習記憶功能的變化。并通過建立體外培養(yǎng)NSCs模型，探討TH對NSCs向神經(jīng)元分化的影響，并以TR及調(diào)控NSCs增殖分化的主要信號通路MAPK(Erk1/2)、mTOR/Akt及JAK/STAT3為切入點探討其相應的分子機制。 方法：①取妊娠0天Balb/c孕鼠，以含PTU(500mg/L)的飲用水喂養(yǎng)至妊娠結束，并在妊娠第0d和第7d腹腔注射PTU(10mg/kg)，建立妊娠期甲狀腺功能減退的動物模型。②于E13.5天時，，采用Real time PCR檢測端腦Tuj1mRNA表達，于E16.5天時，采用免疫組化檢測胎鼠端腦新生神經(jīng)元數(shù)目，探討PTU處理對胚胎鼠神經(jīng)發(fā)生的影響。③采用放免法檢測PTU處理第13d孕鼠及1M齡子代鼠血清TH水平；采用Morris水迷宮實驗檢測子代鼠2M齡時學習記憶功能。④體外分離培養(yǎng)E13.5端腦NSCs，并采用生理濃度T3(0.3nM)處理NSCs，采用Neurosphere assay、CCK-8、TUNEL、Real time PCR及免疫熒光細胞化學檢測T3對NSCs維持、增殖、凋亡及分化的影響，以及分化神經(jīng)元突出生長情況，探討T3對NSCs神經(jīng)元分化的作用。⑤分別采用RT-PCR和免疫熒光細胞化學法檢測在體及離體NSCs上TR mRNA及蛋白表達情況；并通過TRα1特異性siRNA干擾TRα1表達后，進一步觀察T3對NSCs向神經(jīng)元分化的影響，以及對NSCs維持、增殖及凋亡的影響，探討TRα1在T3調(diào)控NSCs向神經(jīng)元分化中的作用。⑥采用Western blot檢測T3對Erk1/2、Akt及STAT3蛋白表達及磷酸化的影響，采用EMSA檢測T3對STAT3-DNA結合活性的影響，探討T3對STAT3信號通路活性的影響。⑦采用TRα1特異性siRNA干擾其表達后觀察T3對STAT3信號通路活性的影響，探討TRα1在T3調(diào)控STAT3信號通路活性中的作用。⑧采用STAT3特異性抑制劑Stattic(5μＭ)處理NSCs后，觀察NSCs向神經(jīng)元分化情況，以及細胞維持及增殖情況，從而探討STAT3信號通路在調(diào)控NSCs向神經(jīng)元分化中的作用。⑨采用STAT3質(zhì)粒轉染在NSCs上過表達STAT3，上調(diào)STAT3信號通路活性，進一步觀察T3對NSCs向神經(jīng)元分化、細胞維持及增殖的影響，探討STAT3信號通路在T3調(diào)控NSCs向神經(jīng)元分化中的作用。⑩采用SPSS13.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。 結果：①妊娠期PTU處理13d后，孕鼠血清FT3及FT4水平明顯低于對照組；而子代鼠出生后1M齡時，血清FT3及FT4濃度無明顯改變；PTU處理16.5d后，胎鼠端腦VZ/SVZ區(qū)Tuj1陽性細胞明顯少于對照組，且端腦Tuj1mRNA表達也顯著降低；子代鼠2M齡時，經(jīng)Morris水迷宮檢測，PTU組尋找平臺的潛伏期明顯長于對照組，而在目的象限搜索時間及穿越虛擬平臺的次數(shù)明顯少于對照組。②生理濃度T3(0.3μＭ)處理NSCs6d后，NSCs向神經(jīng)元分化數(shù)目增多，Tuj1mRNA表達增高，并且分化神經(jīng)元突出總長度、一級分叉點數(shù)目及初級突出數(shù)目均較對照組增加；而向星形膠質(zhì)細胞分化數(shù)目與GFAP mRNA表達減少；處理9d后，可見少突膠質(zhì)細胞分化數(shù)及CNPase mRNA表達明顯增高；同時第一代及第二代神經(jīng)球形成數(shù)目、Sox2mRNA表達與細胞增殖在T3處理后明顯降低，但TUNEL陽性細胞數(shù)目無明顯改變。③TRα1mRNA及蛋白在E13.5離體培養(yǎng)及端腦NSCs上均存在表達，但TRβ不表達；通過TRα1特異性siRNA干擾TRα1表達后，再采用T3處理，發(fā)現(xiàn)T3對NSCs向神經(jīng)元分化及分化神經(jīng)元突出生長的促進作用，對星形膠質(zhì)細胞分化的抑制作用，對細胞增殖和維持的抑制作用均有所逆轉。④生理濃度T3處理1d、2d及3d后，Erk1/2與Akt蛋白表達及磷酸化均無明顯改變，而STAT3蛋白磷酸化顯著降低，進一步研究發(fā)現(xiàn)STAT3-DNA結合活性在T3處理后也明顯降低；⑤采用TRα1特異性siRNA干擾其表達后，再采用T3處理細胞，發(fā)現(xiàn)T3對STAT3磷酸化以及對STAT3-DNA結合活性的抑制作用均顯著減弱。⑥采用STAT3特異性抑制劑Stattic(5μM)處理NSCs后，能夠誘導其向神經(jīng)元分化，抑制其向星形膠質(zhì)細胞分化，且抑制NSCs維持與增殖。⑦通過轉染STAT3質(zhì)粒在NSCs上過表達STAT3，上調(diào)STAT3信號通路活性后，再采用T3處理NSCs，發(fā)現(xiàn)T3對神經(jīng)元分化的促進作用，以及對NSCs維持和增殖的抑制作用均有所逆轉。 結論：①妊娠期TH缺乏損傷成年海馬神經(jīng)發(fā)生，進一步導致學習記憶功能障礙。②生理濃度T3促進NSCs向神經(jīng)元分化及分化神經(jīng)元突出生長，抑制其向星形膠質(zhì)細胞分化，同時抑制NSCs維持與增殖。③TRα1在E13.5離體培養(yǎng)及在體NSCs上均存在表達，且參與介導了T3對NSCs向神經(jīng)元分化的促進作用。④生理濃度T3處理抑制STAT3信號通路活性，且T3對STAT3信號通路的抑制作用需要TRα1介導。⑤抑制STAT3信號通路活性可誘導NSCs向神經(jīng)元分化。⑥上調(diào)STAT3信號通路活性可拮抗T3對NSCs的調(diào)控作用，表明T3通過抑制STAT3信號通路介導了對NSCs向神經(jīng)元分化的促進作用。綜上所述，可得出結論甲狀腺激素通過TRα1下調(diào)STAT3信號通路活性，促進NSCs向神經(jīng)元分化，從而促進端腦神經(jīng)發(fā)生；妊娠期TH缺乏將導致NSCs向神經(jīng)元分化減少，抑制胚胎神經(jīng)發(fā)生，進一步損傷子代成年后學習記憶功能。
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【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R135

【引證文獻】

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1 李丹丹;龐嫵燕;薛磊;;甲狀腺激素缺乏對腦發(fā)育期膠質(zhì)細胞影響的研究[J];中國當代醫(yī)藥;2013年21期

本文編號：1681544